трансгенные организмы- практические применения иинструция


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Гпрспть
МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО
РАЗМНОЖЕНИЯ
РАСТЕНИЙ
Ужцойлб лфмэуйгйспгбойя й ибебшй сбиоьц юубрпг
нйлсплмпобмэопдп сбинопзжойя сбтужойк
................................
............
Фтмпгйя лфмэуйгйспгбойя
Трптпвь лмпо
бмэопдп нйлспсбинопзжойя
Сбвпуб 4.1. ТСБГОЕОИЕ ЭХХЕЛУИГОПТУИ СБИОЫЦ РП
ДПСНПОБМЭОПНФ И НИОЕСБМЭОПНФ ТПТУБГФ РИУБУЕМЭОЫЦ
ТСЕЕ РСИ
ЛФМЭУИГИСПГБОИИ ИИПМИСПГБООЫЦ УЛБОЕК
СБТУЕОИК
................................
................................
................................
.....
Гпрспть
Сбвпуб 4.2. ИОЕФЛЦИа ГПИОИЛОПГЕОИа БЕГЕОУИГОЫЦ РПЧЕЛ
ОЕРПТСЕЕТУГЕООП
ОБ УЛБОаЦ ЭЛТРМБОУ
................................
...
Гпрспть
Сбвпуб
4.3. ПИЕПСПГМЕОИЕ РПТБЕПЧОПДП НБУЕСИБМБ Г
ЛФМЭУФСЕ БРИЛБМЭОЫЦ НЕСИТУЕН
................................
...................
Ибебойж 1. Гьежмжойж й лфмэуйгйспгбойж
брйлбмэоьц нжсйтужн лбсупхжмя
Ибебойж 2. Нйлспсбинопзжойж лбсупхжмя шжсжолпгбойжн рпвждпг
Гпрспть
МОДУЛЬ 5
МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕ
СЕ
ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
................................
....................
Гпрспть
Сбвпуб 6.2. ИИФЧЕОИЕ СБТРСЕЕЕМЕОИа НПМЕЛФМаСОЫЦ НБТТ
ВИПРМБТУИЛПГ НЕУПЕПН ДЕМЭ
ХИМЭУСБЦИИ
...............................
Гпрспть
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ
МИРИЕПГ
, ГЫЕЕМЕООЫЦ ИИ ВИПНБТТЫ RALSTONIA EUTROPHA
5786, НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИИ.
.....................
Гпрспть
МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ
БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.1. ИТТМЕЕПГБОИЕ УЕРМПГЫЕЕМЕОИа И РПУСЕВМЕОИа
ЛИТМПСПЕБ РСИ СПТУЕ ВБЛУЕСИК
................................
.......................
ОГЛАВЛЕНИЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Гпрспть
Сбвпуб 7.2. ПРСЕЕЕМЕОИЕ ГЕМИЧИОЫ ЛПЭХХИЦИЕОУБ
НБТТППУЕБЧИ Г ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ И ЕДП
ГМИаОИЕ ОБ РСПЕФЛУИГОПТУЭ
ВИПУЕЦОПМПДИЧЕТЛПДП
РСПЦЕТТБ
................................
................................
................................
...
Гпрспть
Сбвпуб 7.3. ПРСЕЕЕМЕОИЕ НЕЗХБИОПК РПГЕСЦОПТУИ
Г ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ
................................
................
Гпрспть
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель лабораторн
ого
практикума
, сопровождающего лекционный курс
Современные проблемы и методы биотехнологии,
обучить приемам и
методам по ключевым направлениям современной биотехнологии: геномике
и протемике, технике ведения клеточных культур, новейшим аналитическим
приемам, ключе
вым задачам биоинженерии.
Цикл лабораторных работ направлен на формирование у студентов
представлений о возможностях и уровне современной биотехнологии и ее
методологии; включает следующие разделы:
Трансгенные организмы
Современные методы молекуляр
ной диагности
Культура растительных клеток и тканей
Современные методы исследования целевых продуктов биотехнол
гии
Инженерные основы биотехнологии
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Работы не предусмотрены.
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель
ать представление об основных методах конструирования
трансгенных организмов, о многообразии генетически модифицированных
организмов (ГМО), методах их
идентификации и контроля.
Задачи:
знакомство с основными методами конструирования трансгенных о
ганизмов;
обучение приемам и методам, используемым при создании трансге
ных организмов и их тестировании.
Объект:
бактериальные клетки
coli
, дрожжевые
клетки
экспресс
онные
плазмидные
векторы, растительные трансгенные продукты.
Цель работы
: знакомство с
методами выделения и рестрикционного
анализа ДНК,
получение
экспериментальны
навыков для
конструирования и
анализа рекомбинантных ДНК.
Задачи:
выделение плазмидной ДНК из кишечной палочки
coli
на
примере плазмиды
pUC
содержащего вставку чужеродного гена, оценка
качества полученного препарата с помощью электр
офореза в геле агарозы,
рестрикционный анализ плазмиды,
определение размеров рестрикционных
фрагментов ДНК
Клонирование рекомбинантной ДНК в
общепринятом объекте генно
инженерных исследований
бактерии
coli
практически всегда является
составной частью
процесса получения трансгенного организма. Как правило,
coli
используют для сборки и проверки корректности генетической конс
рукции, а также для получения препаративных количеств рекомбинаниной
ДНК для последующей трансформации целевого организма
в тра
нсгенный.
При этом плазмидные векторы являются наиболее популярными для клон
рования рекомбинантной ДНК.
Плазмиды
внехромосомные автономно реплицирующиеся генетич
е−
ские элементы клетки, представляющие собой преимущественно кольцевые
замкнутые молекулы ДНК
Методы выделения плазмидной ДНК основаны на том, что бактериал
ные плазмиды находятся в кольцевой замкнутой форме и имеют небольшие
размеры по сравнению с геномной ДНК. Первый этап многих методов сост
ит в разрушении жесткой бактериальной клеточной стенк
и путем их обр
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
ботки ЭДТА и лизоцимом (для грамотрицательных бактерий) с образованием
сферопластов. ЭДТА, хелатируя ионы металлов, также защищает ДНК от
действия катион
зависимых нуклеаз. Реакцию проводят в изотоническом
растворе (при достаточно высокой ко
нцентрации сахарозы или другого в
е−
щества) для предотвращения немедленного лизиса получаемых сферопл
а−
стов. Затем сферопласты лизируют, например, путем добавления детергента.
Клеточный дебрис и фрагменты бактериальной хромосомы, связанные с кл
е−
точной оболочк
ой, можно удалить центрифугированием или фильтрованием.
Из различных методов выделения плазмид наиболее широко использ
ется метод щелочного лизиса бактерий (метод Бирнбойма
Доли) и его м
дификации, как для получения мини
препаратов, так для крупномасштаб
ного
выделения ДНК. Метод основан на том, что в щелочных условиях
рН 12,0
12,5
происходит денатурация линейных молекул ДНК (расплет
е−
ние двойной спирали), в то время как кольцевые замкнутые молекулы не д
натурируют или денатурируют незначительно и
обратимо. Когда клеточный
экстракт нейтрализуют при высокой концентрации соли, белки, геномная
ДНК и клеточная РНК осаждаются. Происходит это, по
видимому, потому,
что длинные одноцепочечные молекулы ДНК и РНК реассоциируют в выс
кой соли после денатурации
случайным и беспорядочным образом, образуя
нерастворимую массу. Большая часть клеточной РНК осаждается вместе с
белками, поскольку реакцию проводят в
присутствии додецилсульфата
SDS
. Оставшуюся клеточную РНК в препарате удаляют обработкой РНК
а−
зой А (
в основном это транспортная РНК, которая,
видимо,
вследствие
легк
сти образования внутримолекулярных двухцепочечных участков
сравн
тельно легко
ренатурирует и
растворяется в высокой соли
После удаления осадка центрифугированием плазмидную ДНК оса
дают и
з осветленного клеточного лизата этанолом или изопропанолом. Такой
препарат ДНК можно использовать для многих целей, например, для рес
рикционного анализа. Для многих других приложений часто необходимы б
лее чистые препараты ДНК, например, для подготовки ф
рагментов к клон
рованию или для трансфекции
в таком случае ДНК подвергают дальнейшей
очистке.
Для получения высокочистых препаратов небольших по размерам
ДНК, пригодных для практически всех
молекулярно
биологических
прил
жений, очень популярен метод очи
стки ДНК на колонках с
фильтрами из
стекла (
glass
, кварца
silica
slurries
или силикагеля (
silica
gel
membrane
).
DNA обратимо сорбируется на поверхность стеклянной мембраны в растворе
с высокой концентрацией хаотропной соли, примеси отмываются хаотропной
солью и
% этанолом
. Затем
очищенная DNA элюируется в буфере с ни
кой ионной силой
Для очистки небольших количеств плазмидной ДНК или
фрагментов часто используют центрифужные мини
колонки с такими сил
катными фильтрами. Подобные наборы выпускаются мног
ими фирмами.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
ермостатируемый шейкер
инкубатор Exellα E
24, «New
Brunswick»
(СЧА)
для выращивания клеточных культур
истема
видео
документирования гелей
Molecular
Imager
Gel
Doc
производства
Bio
(СЧА)
с
трансиллюминатором
икроцентрифуга для пробирок Eππeνdoρφ 5417R
(СЧА)
c ротором
для микропробирок 1
мл
борудование
для горизонтального
ДНК
гель
электр
фореза
фирмы
«Bio
Rad»
(СЧА): и
сточник постоянного тока
PowerPac HV Power Supply
Sub
Cell
камеры с заливочным
столик
ами
абораторный шейкер
вортекс
1 фирмы
«BioSan»
хлаждаемый т
ермостат
модель КВ53
фирмы
«Binder»
(Германия)
абор
из трех автоматических пипеток на 2
20 мкл, на 20
200 мкл и
на 100
1000 мкл
Gilson
ерные с
таканы и колбы, одноразовые пластиковые пробирки и нак
нечники для пипеток
тационарная культура
coli
содержащая рекомбинантную плазмиду
уферы и реагенты для выделения плазмидн
ДНК
уферы и реагенты для
рестрикционного анализа
ДНК
уферы и реагенты
для
проведения
агарозного электрофореза.
Характеристика об
рудования
Рис. 2.1.
Внешний
вид
ермостатируем
шейкер
инкубатор
Exella
фирмы
New
Brunswick
Термостатируемый шейкер
инкубатор Exellα E
24 «New Brunswick»
рис. 2.1
позволяет выращивать клеточные культуры в широком диапазоне
температур и в различных объемах от микробиологических пробирок
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
на 2
5 мл до крупных колб 2,8 л. Ростовая камера плотно закрываетс
я пр
зрачной акриловой крышкой, что позволяет непосредственно наблюдать за
выращиваемыми образцами.
Технические характеристики
Диапазон температур инкубации от 7
С выше окружающей до 60
Диапазон частот качания
400 раз
/мин
Орбитальное качание
см в диаметре.
Универсальный температурный контроль обеспечивается самокорре
тирующимся микропроцессорным контролем обратной связи и герметично
сконструированной ростовой камерой. Высокоскоростной вентилятор обе
с−
печивает быстрое вос
становление температуры при перегреве.
Установка температур
и скорости осуществляется через контрольную
панель.
Прозрачная крышка ростовой камеры позволяет непосредственно н
а−
блюдать за образцами и минимизировать количество открываний шейкера.
Крышка легко
поднимается, открывая удобный доступ к образцам.
232
обеспечивает регистрацию и хранение данных о состоянии
прибора.
Качание шейкера автоматически отключается при открывании крышки
для защиты оператора.
Система безопасности термостата выключает нагрев
при превышении
установленного температурного лимита для защиты растущей культуры.
Система видеодокументации 
Molecular
Imager
Gel
Doc
рис. 2.2
производства 
Bio
 с трансиллюминатором
позволяет осуществлять ряд
работ по получению цифровых изображений результатов экспериментов: от
рутинной документации гелей до высокочувствительной хемилюминесцен
ной детекции и регистрации с высоким разрешением двумерных гелей. Си
с−
тема имеет широкий ряд
применений, в
числе детекция нуклеиновых к
слот, иммуноблоттинг, двумерный гель
электрофорез, дот
блоттинг, денс
тометрия, подсчет количества колоний. Система Moleculαρ
Imager
Gel
 включает в себя темный кабинет с переключаемым держателем филь
ов на 5 штук (один желтый встроен по умолчанию),
видеокамеру, и
с−
точники УФ и белого света, принтер, управляющий
компьютер с програм
м−
ным обеспечением Quαντiτy Oνe для захвата и обработки изображений.
Конверсионный экран XciταBlue для ДНК
имиджинга в
комплекте предо
вращает образцы ДНК и поль
зователя от УФ
облучения
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Рис. 2.2.
Внешний вид с
истем
видеодокументирования
Molecular
Imager
Gel
Doc
производства
Bio
Rad
Технические характеристики
Церно
белая 12
битная (4096 оттенков серого)
видеокамера
с 1360х1024 мкм
матрицей и разрешением 1,4 мегапиксела. Размер пиксела
4,6х4,6 мкм.
Чирок
й динамический ряд видеодетекции, покрывающий более
тре
порядков.
Видеокамера с автоматическим моторизованным увеличением
8,5
51 мм и цифровой обратной
связью для воспроизводимости условий д
кументирования.
Отображение на экране в реальном времени для быстрого позицион
рования и фокусирования образца.
Для освещения используется проходящий УФ
свет, проходящий и о
раженный белый свет.
Встроенный трансиллюми
натор с переключаемым 254, 302, и 365 нм
излучением. Зона трансиллюминации 25х26 см.
Пяти
позиционный держатель эмиссионных
фильтр
ов с одним
встр
енным
(желтый), возможно встраивание дополнительных
четыре
х эмиссио
ных фильтров в зависимости от потребнос
тей.
Программное управление источниками освещения.
Программное обеспечение совместимо с
Windows
MAC
Размеры системы 60х36х96 см,
масса
32 кг.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Рис. 2.3. Охлаждаемая м
икроцентрифуга 5417
ротором для микропробирок
фирмы
Eppendorf
Микроцентрифуга 
Eppendorf
» 5417
ротором для микропробирок
рис. 2.3
, укомплектованная аэрозолезащищенным угловым 30
позици
онным ротором для микропробирок
позволяет центрифугировать любые о
зцы в микропробирках 0
мл на разнообразных режимах с переме
ным ускорением до 20
800 g. Характеризуется большой мощностью, малым
временем разгона и остановки, большим центростремительным ускорением.
Имеет режимы медленного и быстрого замораживания, р
аботает в диапазоне
температур от
°С до 40
°С. Функция охлаждения позволяет быстро охла
дать образцы до 4
°С примерно за 15 мин и постоянно поддерживать эту те
м−
пературу в течение времени центрифугирования при максимальной скорости
вращения. Возможна доу
комплектация другими роторами, например, бакет
ротором или рото
ром для стрипов
Технические характеристики
Удобная мембранная клавиатура
для установки режимов центрифуг
рования
араметры можно менять
в процессе работы центрифуги
Макс
имальная
скорость вращения
400 об/мин (от 500 об/мин до
максимального значения, с инкрементом 100 об/мин)
Установление показаний вращения в единицах об/мин или в единицах g.
Максимальное у
скорение (ρcφ)
коло 25
000
g (в соответствии с DIN
58970)
для
позиционного углового ротора
14 000 об/мин (20
800 g
Быстрый разгон и торможение даже пр
и полностью заполненном рот
ре.
Время разгона до макс
имальной с
корости
около
10 с
, в
ремя торможения
с макс
имальной
корости
около
11 с (с 30
позиционным
угловым
ротором).
Режим "Soφτ" для боле
е мягкого разгона и торможения.
Встроенный таймер до 99 мин
с возмож
стью
непрерывно
го центр
фугирования.
Функция кратковременного центрифугирования
с выбранной скор
стью
вращения
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Все съемные элементы
роторы, крышки, адап
теры могут автоклав
роватьс
я в течение 20 мин при 121
°С.
Габариты: 31х60х25 см,
масса
(без ротора)
35 кг.
Потребляемая
ощность 700 Ω, питание 230V/50
60 Hz.
Оборудование для горизонтального гель
электр
фореза
рис. 2.4
: и
с−
точник постоянного тока 
PowerPac
Power
Supply
 и 
Sub
Cell
 к
а−
меры с заливочными столиками фирмы Bio
Rαd предназначено для пров
дения горизонтального электрофореза в гелях агарозы различного размера
при анализе
нуклеиновых кислот. Включает в себя удобный столик для з
ливки гелей, УФ
прозрачные подложки для гелей, гребенки различных фо
матов для формирования лунок. Пр
граммируемый источник постоянного
тока 
PowerPac
Power
Supply
 способен поддерживать ток до 50
00 В,
500 мА и 400 Вт, что позволяет использовать его для всех высоковольтных
методов, включая низкотоковые в микроамперном диапазоне. Кроме гор
зонтального ДНК
электрофореза может быть использован также в ряде др
гих методов, включая
SDS
электрофорез белк
ов, изоэлектрическое фокус
рование, ДНК
секвенирование
Рис. 2.4.
Внешний вид
оборудования для гель
электрофореза ДНК
фирмы
«Bio
Rad»
источник питания, заливочный столик и камеры
Технические характеристики э/ф камер
Размер
подложки для гелей 7х10 см для камеры
Mini
Sub
Cell
позволяют внедрять два ряда гребенок в гель для увеличения количества ан
а−
лизируемых образцов
от
до 30.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Размер
подложки для гелей 15х25 для камеры
Sub
Cell
позв
ляют внедрять четыре ряда г
ребенок в гель для увеличения количества ан
а−
лизируемых образцов
от 1 до 120.
Объем электрофорезного буфера ~270 мл для камеры
Mini
Sub
Cell
и ~1 л для камеры
Sub
Cell
Технические характеристики источника питания для электрофореза
PowerPac
Power
Supply
Способен
поддерживать постоянный ток в диапазонах 20
5000 В,
0,01
500 мА, 1
400 Вт.
Возможно подключение до
четыре
х камер одновр
е−
менно.
Программируемый источник питания позволяет осуществлять мног
ступенчатые методы, процессы с изменяемыми
параметрами, при постоя
ном токе, при постоянном напряжении, при постоянной мощности или при
постоянной температуре.
Лабораторный шейкер
вортекс Вортекс V
1 фирмы BioSαν (Ла
вия) предназначен для перемешивания растворов и суспензий клеток в л
бых проб
ирках. Имеет два режима работы
непрерывный и импульсный.
Импульсный режим включается при касании пробиркой го
ловки вортекса
Рис. 2.5.
Внешний вид
шейкер
вортекс
фирмы Биосан
Технические характеристики
Диапазон регулирования скорости
250
3000 об./мин
Предназначен д
ля пробирок объемом
50 мл
Максимальный объям перемешивания
30 мл
Питание
от в
нешн
его
блок
DC 12 В, 500 мA
Масса
не более
1,1 кг
Размеры
90x150x80 мм
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Охлаждаемый термостат КВ53 фирмы Biνdeρ (Германия) объемом
рис. 2.6
, предназначен для инкубации разнообразных образцов при
различных температурах от
10 °C до 100 °C с высокой точностью
Рис. 2.6.
Термостат КВ53 фирмы Biνdeρ (Германия)
Техничес
кие характеристики
егулируемый диапазон температур от
°C до 100
с точностью
0,3
икропроцессорн
онтроль многочисленных временных и темпер
а−
турных функций
осуществляется
с ЕК
дисплея
с визуальной и акустической
сигнализацией
нтерфейс RS 422
для принтера или компьютера.
Мощная з
апатентованная система охлаждения DCT
обеспечивает н
а−
дежность поддержания температур без образования конденсата
Не наносящий вреда окружающей среде охладитель R134α
Абсолютная воспроизводимость условий инкубации и р
азмножения
рограммируемая (от 0 до 100 %) принудительная конвекция (вентил
я−
тор)
ытяжное устройство с заслонкой для сушки
Вспененная изоляция, не содержащая хлорфторуглеродов
нутренняя стеклянная дверь
, две полки с возможностью установки
четырех.
гофункциональный таймер от 0 до 99 ч 59 мин
азмеры камеры Ч x В x Г см: 40 x 40 x 33
бъем 53 л
абар
иты Ч x В x Г см: 64 x 84 x 58,
масса 72
Мощность
460
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Ход работы:
1. Культуру
coli
содержащую рекомбинантную плазмиду
pUC
центрифугировать
2 мин
в 2 мл пробирках при 8 об/мин. Культуральную ср
е−
ду вылить, осадок осушить.
2.
Ресуспендировать осадок в
100
л раствора 1 (25 µM Tρiσ
HCl pH
0, 10 mM EDTA, 50 mM
глюкозы, РНКаза А
) с лизоц
имом (на кончике
шпателя
на 10 мл
), инкубировать 5 мин при комнатной температуре
3. Добавить 200 мкл раствора 2 (0
2 M NαOH, 1 10% SDS). Инкубир
вать с мягким перемешиванием
перевертыванием пробирки до полной пр
зрачности, но не более 5 мин.
4. Добавить 200 мкл 3 M NαOAc πH 4
75, смешать переворачиванием и
инкубировать 5 мин, периодически помешивая.
5. Центрифугировать на максимальных оборотах 10 мин (~16 тыс
об/мин).
6. Супернатант
осторожно, не разрушая осадок,
прилить к 1 мл этанола,
пере
мешать и центрифугировать 2 мин на максимальных оборотах.
7. Осадок промыть 1 мл 70
% этанол
перемешиванием на вортексе, з
а−
тем центрифугировать 2 мин на максимальных оборотах.
8.
Супернатант удалить, осадок
подсушить на воздухе 10 мин и раств
рить в
0 м
кл ТЕ (10 µM Tρiσ
HCl pH 8.0, 1 mM EDTA).
Для оценки количеств
а и качества
ДНК
а также размеров молекул
ДНК используют электрофорез в гелях агарозы (гориз
онтальный) или пол
акриламидных гелях (вертикальный электрофорез). Молекулы ДНК визуал
зируются интеркалирующими флуоресцентными красителями, например,
бромистым этидием. Двуцепочечная ДНК эффективно связывает бромистый
этидий и начинает ярко флуоресцирова
ть при облучении ультрафиолетом
(УФ).
Результаты
электрофореза
документируют в проходящем УФ
свете с
помощью цифровой фотокамеры или специальной системы для документ
рования гелей.
лазмидн
ая
интактная
ДНК
из клетки выделяется обычно в нескольких
формах, к
оторые разделяются в процессе электрофореза (
рис. 2.7
). В хор
шем препарате ДНК доминирует
суперскрученная мономерная и димерная
формы (суперспиральная плазмида),
при некотором повреждении ДНК поя
ляются
релаксированная
форма (расплетенное кольцо, к чему приводит н
а−
личие разрыва в одной из цепей), редко бывает линейная форма, образу
щаяся при двуцепочечных разрывах плазмидного кольца. В препарате пла
мидной ДНК возможна небольшая примесь денатуриров
анной ДНК, а также
фракци
РНК.
Денатурированная форма образуется при необратимых сдв
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
гах цепей плазмидного кольца относительно друг друга в процессе денатур
а−
ции. Рестриктазы не опознают сайты на такой ДНК с нарушенной двуцеп
чечной структурой и, соответст
венно, не расщепляют данную фракцию ДНК
рис. 2.7
). Подвижность полос с формами кольцевой плазмиды зависит от у
с−
ловий электрофореза и концентрации бромистого этидия, так как внедрение
интеркалирующи
х красителей расплетает ДНК, изменяя ее конформацию.
Суммарное количество плазмидной ДНК во внесенной в гель пробе оцен
вают путем сопоставления интенсивности свечения
полос со стандартной
ДНК маркеров.
Рис.
Пример электрофореза в 1 % геле
агарозы, окрашен бромистым этидием.
интектная плазмида, 2
линейная плазмида после расщепления уникальной рестрикт
зой (один сайт на молекулу), 3
маркеры молекулярного веса, длины в тысячах нукле
тидных пар. Формы интактной плазмиды: Ден
денатурир
ованная, Сс
суперскруче
ная мономерная, Сс
суперскрученная димерная, Рел
релаксированная, линейная
форма в данном препарате отсутствует
Ход работы:
1. Приготовить буфер ТАЕ (40 мМ Трис
ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8
0)
для электрофореза разведением сто
кового раствора ТАЕх50.
2. Приготовить 1
% гель агарозы на ТАЕ
буфере путем расплавления
навески агарозы в микроволновой печи. После остывания до умеренно гор
я−
чего состояния добавить бромистый этидий до 0
25 мкг/мл и залить гель
в форму.
3. Нанести 1 и 2 м
кл полученного препарата рядом с 1 мкл маркерной
ДНК в лунки приготовленного 1
% геля агарозы. Образцы перед нанесением
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
смешивают с 1 мкл буфера для нанесения и электрофорезным буфером так,
чтобы наносимый объем составил 10
15 мкл, для равномерного
распредел
е−
ния ДНК по толщине геля.
4. Провести электрофорез в течение 30 мин при напряжении 100 В.
5. С помощью системы видеодокументации получить фотографию геля
проходящем УФ
свете при длине волны 260
нм.
6.
Идентифицир
овать
полосы плазмидной ДНК
в пре
парате. Оценить
суммарное
количество плазмидной ДНК во вне
сенной в гель пробе
путем с
поставления интенсивности свечения
полос полученного препарата
с
инте
сивность
свечения
стандарт
ной ДНК
. После этого пересчит
ать
количество
полученной
ДНК на общий объем
препарата.
7. Записать вывод о качестве и количестве полученного препарата
плазмидной ДНК.
Ре
стриктазы
или, более корректно, рестрикционные эндонуклеазы, я
ляются важнейшими инстр
ументами создания рекомбинантных ДНК и физ
ческого картирования ДНК
молекул.
Ре
стриктазы расщепля
ют двухцепоче
ную ДНК
внутри молекулы.
При этом каждая рестриктаза узнаят определя
ный участок ДНК длиной от четырях пар нуклеотидов
(сайт узнавания)
расщепл
яет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его
(сайт
расщепления). Наиболее широкое применение в генной инженерии нашли
высокоспецифичные рестриктазы, узнающие палиндромные последовател
ности ДНК и расщепляющие
ДНК
молекулу внутри сайта узнавания.
При
этом могут образовываться концы цепей трех структурных типов. Если ра
рыв происходит посередине сайта рестрикции, то образуются фрагменты с
полностью спаренными ("тупыми") концами. Когда расщепление ДНК пр
исходит в ст
ороне от середины сайта, образуются выступающие однонитевые
концы, получившие название "липких", т.
е. способных "слипаться" с ко
плементарным концом, образующимся в противоположной цепи в результате
ее разрыв
а.
Цисло нуклеотидов в однонитевом концевом уча
стке может вар
ировать от одного до пяти.
Молекулы ДНК из разных источников, обработанные одной и той же
высокоспецифичной рестриктазой, расщепляющей палиндромные послед
вательности, будут иметь одинаковые гибридизующиеся между собой липкие
концы. Наличие
таких липких концов у фрагментов ДНК существенно о
легчает их ковалентное сшивание специальным ферментом ДНК
лигазой
(лигирование) в рекомбинантную молекулу.
Поскольку рестриктазы узнают специфические последовательности в
молекуле ДНК, становится возможным
физически определить месторасп
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.1. ГЫЕЕМЕОИЕ И БОБМИИ РМБИНИЕОПК ЕОЛ ИИ ВБЛУЕСИБМЭОЫЦ ЛМЕУПЛ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
ложение таких последовательностей, обрабатывая ДНК соответствующими
рестриктазами. Физическую карту молекулы ДНК по рестрикционным са
там можно составить, анализируя длины фрагментов ДНК после расщепл
ния различными рестрикт
азами.
Ход работы:
1. На основании физической карты плазмиды выбрать
три
рестриктазы
для проведения расщепления
полученного пре
арата плазмидной ДНК
в двух
вариантах
реакции гидролиза двумя рестриктазами одновременно
2.
Для каждого из вариантов и
каталога фирмы
поставщика (Сибэ
зим) выбрать состав реакционн
смес
и,
в котор
одновременно активны
обе
из используемых рестриктаз
3. По данным о
пределения содержания ДНК в полученно
репарате
выбра
объемы проб
для
рестрикци
онного анализа. О
предел
необход
количеств
о единиц активности
рестриктаз
для полного гидролиза п
лученного препарата за 30 мин и в соответствии с этим добавляемый объем
фермента. Записать состав
реакционной смеси.
4. Собрать реакции в двух вариантах и инкубировать 30 мин пр
и опт
мальной температуре расщепления для конкретных ферментов. В качестве
отрицательного контроля ставится
проба ДНК
без добавления
фермент
ов
всего 3 микропробирки.
5. Провести электрофорез гидролизованных образцов в 1
% геле агар
зы вместе с маркерными
ДНК.
6. Оценить полноту расщепления пробы и размер полученных рестри
ционных фрагментов. Сопоставить полученный размер с ожидаемым согла
но физической карте плазмиды. Записать выводы.
1. Цто представляют собой плазмиды?
2. На чем основаны методы
разделения хромосомной и плазмидной
ДНК в клетке?
3.
Каков
принцип щелочного метода выделения плазмидной ДНК
4. На чем основано разделение макромолекул ДНК при агарозном гель
электрофорезе?
5. Как можно определить размер молекул ДНК?
6. Какие формы плазм
идной ДНК можно увидеть после электрофореза
полученного препарата в агарозном геле?
7. Каково происхождение рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз)?
8.
аково з
начение открытия рестриктаз для развития методов клон
рования и физического картирования ДНК
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель работы:
ать представление о
различных методах введения ч
жеродной ДНК в клетки
мишени. П
олучение экспериментальны
навыков
по
созданию генетически
модифицированных организмов на примере клеток
и дрожжей.
Задача работы:
ровести эксперимент по трансформации
клеток
oli
и дрожжей рекомбинантным челночным вектором
pPZA
двумя разли
ными способами
имическ
трансформаци
ей
и электропораци
, прод
е−
монстрировать связи ДНК
→РНК→
белок
свойство
организма
Трансформация
применительно к доставке чужеродной ДНК в
кле
ку в самом общем значении термин обозначает
процесс введения свободной
ДНК в клетку
. В более узком значении, как метод доставки ДНК, термин
применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс п
глощения рекомбинантной ДНК компетентными
клетками,
индуцированный
температурным фазовым переходом клеточной мембраны.
coli
является
самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК,
чтобы обеспечить
внедрение
в клетки плазмидной ДНК,
клетки выдерж
вают с
ледяным раствором
СаС1
и ДНК
, а затем
подвергают тепловому ш
при 42 °С в течение
1 мин. По
видимому, в результате такой обработки
происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность тран
с−
формации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг доба
ленной ДНК,
при этом
составляет примерно 10
Эффективность этого
метода невысока, приблизительно менее 0
% клеток оказываются тран
с−
формированными,
но этот недостаток компенсируется применением схем о
бора, позволяющих быстро идентифицировать
нужные
клоны
Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются комп
е−
тентными. Доля компетентных клеток в популяции обычно очень мала, но ее
можно повысить, используя специальную питательную среду, условия кул
тивирования и химические индукторы компетентност
и (подобранные, как
правило, эмпирически). Цасто этапом подготовки компетентных клеток идет
получе
ние сферопластов
клеток, частично или полностью (протопласты)
лишенных наружной ригидной клеточной стенки. Н
апример,
только таким
способом была осуществлена
эффективная трансформация многих грамп
ложительных бактерий
родов
Bacillus
Listeria
Streptommyces
и др.
екот
рые методики т
рансформаци
дрожжей
также
включа
стадии фермент
а−
тивного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз.
Для
организмов
, устойчивых к
химически
индуктор
компетентности
или не
обладающих природной компетентностью, применяются другие системы
доставки ДНК
Одним из
популярны
х методов введения нуклеиновых кислот в клетки
мишени является
элект
ропорация
временное создание пор в бислойной
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОР
ГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.2. Ггжежойж шфзжспео
пк ЕОЛ г лмжулй еспззжк й в
блужсйк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
липидной мембране под кратким воздействием электрического поля.
Это
универсальны
физически
метод трансформации, методика которого разр
а−
ботана практически для всех типов клеток.
Для многих типов клеток
служит
единстве
нны
способ
высокоэффективной трансформации.
При работе с
E. coli
подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и
ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока дл
тельностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами
1 мм
. После такой обработки эффективность трансформации повышается до
для малых плазмид (~3
6 тпн) и до 10
для больших (~135 тпн).
Аналогичные условия используют для введения в
Е.
coli
вектора ВАС. Эле
тропорирующий эффект высоковольтного разряда на
бислойную липидную
мембрану, по
видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие
бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно бол
шей напряженности (12
18 кВ/см), чем крупные животные и растительные
клетки, эффективно поглощающие Д
НК при напряженности поля 1
2 кВ/см.
Электропорация
наиболее простой, эффективный и воспроизводимый м
е−
тод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального пр
бора электропоратора.
ермостатируемый шейкер
инкубато
р Exellα E
24, «New Brunswick»
(СА)
для выращивания клеточных культур
(см. работу 2.1
окс
ламинар БАВнп
"Ламинар
1,2 производства Ламинарные
системы
(Россия)
, I класс защиты (
рис.
2.8
икроцентрифуга для пробирок Eππeνdoρφ 5417R
(СЧА)
c ротором
для микропробирок 1
мл (
см. работу 2.1
абораторный шейкер
вортекс Вортекс V
1 фирмы
BioSαν (см. р
а−
боту 2.1
ермостат модель КВ53, Biνdeρ
(Германия)
(см. работу 2.1
ниверсальный электропоратор GeνePulσeρ Xсell фирмы Bio
Rad»
(СЧА)
с одноразовыми кюветами для электропорации (
рис.
2.9
одяная баня
термостат ΩB
4MS фирмы BioSαν (
рис.
2.10
амороженные химически к
омпетентные клетки
E. coli
Blue
имически к
омпетентные клетки
метилотрофных дрожжей
Pichia
toris
лектрокомпетентные
клетки
дрожжей
Pichia
pastoris
аствор плазмидной
рекомбинантной
ДНК
челночного экспрессионн
го вектора
pPZA
блеомицин
овй устойчивостью, несущего вставку чуж
е−
родного гена
еагенты для химической трансформации дрожжей
Pichia
pastoris
LiCl
гар на LB среде
нтибиотик блеомицин 100
мг/мл
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОР
ГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.2. Ггжежойж шфзжспео
пк ЕОЛ г лмжулй еспззжк й в
блужсйк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
ашки Петри
терильная одноразовая пластиковая посуда (наконечники, микропр
бирки), шпатели для растирания культур
ластиковые пробирки Eππeνdoρφ
онтейнер со льдом, водяная баня (42
С), термостат (37
Характеристика оборудования
Бокс
ламинар
БАВнп
"Ламинар
1,2 производства Ламина
ные системы (Россия),
класс защиты
предназначен для создания беспыл
вой абактериальной воздушной среды. Используется при работе с препарат
а−
ми и бактериальными культурами, не представляющими угрозы для зд
оровья
оператора, когда необходима защита рабочего материала от окружающей
среды или работа с объектом требует стерильной рабочей зоны
Технические характеристики
Габариты рабочей камеры ламинарного бокса (ЧхГхВ) 1105х620х670
мм
, внешние габариты
1170х685х
1115
мм,
масса
145 кг.
Две встроенные розетки
лоская несъемная столешница из полированной нержавеющей стали
ильд
панель с
экраном, индицирующим включение систем изд
е−
лия
аймер работы УФО рабочей камеры, счетчик наработки УФО, часы,
технологический
таймер
вухступенчатая система фильтрации (классы фильтров G4
(предвар
тельная очистка)
, НЕРА Н14)
, к
ласс чистоты воздуха рабочей зоны ламина
ного бокса по ГОСТ Р ИСО 14644
2002 (по частицам 0,5 мкм)
5ИСО
истема автоматического поддержания потока
воздуха
со с
корость
воздушного потока
0,45±10
% м/с
Производительность ламинарного бокса
800 м
Освещенность рабочей зоны ламинарного бокса
1000
Универсальный электропоратор 
GenePulser
ell
Total
System
 фирмы
Bio
Rad
 с одноразовыми кюветами дл
я электропорации
рис. 2.9
является
эффек
тивной альтернативой другим способам доставки экзогенных молекул
в клетку
хозяина.
Универсальная система электропорации GeνePulσeρ Xсell
Total System»
фирмы Bio
Rαd с электропорационной ячейкой предназнач
е−
на для эффективного внедрения нуклеиновых кислот, белков, углеводов, кр
сителей, вирусных частиц и других молекул как в прокариотические, так и в
эукариотические клетки.
Здесь электропорация
осуществл
яется либо эксп
ненциальным, либо квадратноволновым пульсом для подбора максимальной
трансформационной эффективности. Система включает три модуля (гла
ный, CE модуль для эукариот и РС
модуль для прокариот) и электропорац
онную ячейку
Shockpod
. В комплект
е ряд предустановленных оптимиз
рованных протоколов для большинства широко используемых типов клеток.
становленные протоколы разработаны с возможностью их оптимизации и
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОР
ГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.2. Ггжежойж шфзжспео
пк ЕОЛ г лмжулй еспззжк й в
блужсйк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
создания новых
протоколов
для повышения эффективности трансфекции и
увеличения жизнесп
особности любых типов клеток.
Рис. 2.8.
Внешний вид
ламинара
БАВнп
"Ламинар
производства 
Ламинарные системы (Россия),
класс защиты
Рис. 2.9.
Внешний вид
ниверсальн
электропоратор
GeνePulσeρ Xсell
Total
System
фирмы Bio
Rαd с
электропорационной ячейкой
«Shockpod»
Технические характеристики
Электропорация проводится в одноразовых кюветах 0,1 мм, 0,2
мм
и 0
4 мм.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОР
ГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.2. Ггжежойж шфзжспео
пк ЕОЛ г лмжулй еспззжк й в
блужсйк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Форма пульсовой волны
экпоненциальная или квадратная с изменя
е−
мым напряжением 10
3000 В.
лектрическая емкость
в диапазоне 10
500 В
3275 мкФ с 25 мкФ
инкрементом, в диапазоне 500
3000 В
10, 25 и 50 мкФ.
Длительность квадратно
волнового пульса: в диапазоне 10
500 В
продолжительность 0,05
10 мс с 0,05 мс
инкрементом, продолжительность
100 мс с 1 мс
инкрементом, 1
10 пульсов с 0,1
10 с интервалом. В диап
а−
зоне 500
3000 В
продолжительность 0,05
5 мс с 0,05 мс
инкрементом,
2 пульса с интервалом
минимум 5 с.
Сопротивление образца
20
минимум при 10
2500 В, 600
мин
мум при 2500
3000
Удобный цифровой интерфейс с интуитивно программируемым ко
тролем всех параметров. Встроенные оптимизированные протоколы и созд
а−
ваемые заново
модифицируемые протоколы для специфических задач для
получения лучшей доставки
молекул в клетки.
Хранение и вы
зов параметров
пульса для последних 100 экспериме
тов.
Водяная баня
термостат
фирмы 
BioSan
предназначен
для
проведения химических, фармацевтических, медицинских и биологических
исследований. Модель ΩB
4MS обеспечивает повышенную стабилизацию
температуры (до 0,1 °С) за счет работы встроенной магнитной
мешалки
Рис.
одян
ая
баня
термостат ΩB
4MS фи
рмы 
BioSan
Технические характеристики
Диапазон регулировки температуры
100
с
0,1
точностью,
цифровая установка, ЕК
дисплей.
егулировк
оборотов
магнитной мешалки в д
иапазон
300
1000
об/мин.
Емкость ванны
из нержавеющей стали 4 л, габариты
50 м
масса
не более 3,6 кг.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОР
ГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.2. Ггжежойж шфзжспео
пк ЕОЛ г лмжулй еспззжк й в
блужсйк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
отребляемая мощность не более 600
Вт.
Ход работы
1.
Подписать две пластиковые пробирки +ДНК и
ДНК
2.
ламинарном
боксе стерильно отобрать по
0 мкл суспензии
комп
е−
тентных клеток в трансформационном буфере в каждую пробирку. Поме
с−
тить пробирки в ледяную баню.
3.
В пробирку +ДНК внести 1 мкл раствора плазмидной ДНК. В пр
бирку
ДНК внести такое же количество буфера без ДНК. Выдержать обе
смеси на льду
0 мин.
Расплавить агар в микроволновой печи
и залить чашки с анти
биотиком и без него
Конечная концентрация блеомицина для клеток
25 мкг/мл, для дрожжевых клеток 100 мкг/мл.
5. Высушить залитые агаром чашки
под
облучением
ламинарном
боксе.
6.
Провести процедуру теплового шока. Для этого обе пробирки поме
с−
тить в водяную баню (42
на 25 с
(строго!), после чего быстро перенести
их опять на лед. Выдержать 2
3 мин.
7.
Пробирки вынуть изо льда, добавить по
50 мкл свежей
LB
среды
(стерильно!) и и
нкубировать при 37
С в тече
ние 30 мин.
8.
Высеять полученные клетки на соответствующие чашки с агаром.
Для этого отобрать по 100 мкл клеточной суспензии и перенести ее на п
верхность агара. Растереть стерильной стеклянной петлей досуха, закрыть
чашки,
перевернуть и поместить в термостат (37
С) на ночь.
9. Проанализировать полученные результаты. Сра
ните количество в
росших колоний на чашках с антибиотиком и без.
10. Определите эффективность трансформации по формуле
Эфф. трансф. = число колоний на ча
шке / кол
во ДНК на чашку (мкг)
Ход работы
1.
Подписать две пластиковые пробирки +ДНК и
ДНК
2.
ламинарном
боксе стерильно отобрать по
0 мкл суспензии
эле
трокомпетентных клеток в воде
каждую пробирку. Поместить пробирки в
ледяную баню.
3.
В пробирку +ДНК внести 1 мкл раствора плазмидной ДНК
в воде
В пробирку
ДНК внести такое же количество буфера без ДНК.
Перемешать.
4. Перенести смесь клеток с ДНК в электропорационную кювету
1 мм.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОР
ГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.2. Ггжежойж шфзжспео
пк ЕОЛ г лмжулй еспззжк й в
блужсйк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
5.
Провести процедуру
электропорации при 1800 кВ пульсе согласно
инструкции к прибору.
6. Сразу же добавить к клеткам
SOC
среду и поместить их в термостат
на 30 мин при
, лучше с перемешиванием.
7.
Высеять полученные клетки на соответствующие чашки с
агаром.
Для этого отобрать по 100 мкл клеточной суспензии и перенести ее на п
верхность агара. Растереть стерильной стеклянной петлей досуха, закрыть
чашки, перевернуть и поместить в термостат (37
С) на ночь.
9. Проанализировать полученные результаты. Ср
авнит
количество в
росших колоний на чашках с антибиотиком и без.
10. Определит
эффективность трансформации аналогично п. 10 задачи
2.1.1 и сравнить ее с полученной для химически компетентных клеток.
1.
Цто такое генетическая трансформация?
Цто такое компетентные клетки? Как вы себе представляете процесс
проникновения плазмидной ДНК внутрь клеток в момент температурного
шока?
3.
Каков
процесс проникновения молекул рекомбинантной ДНК внутрь
клеток в процессе электропорации
4.
Почему для
проведения генетических модификаций чаще всего и
с−
пользуют клетки
coli
? Какие еще организмы используются в биотехнол
гии?
5.
Какова эффективность проведенной вами трансформации? От чего
она зависит?
Цель работы
знакомство с постановкой определения
генетически
дифицированных ороганизмов (
ГМО
, процедурами
выделения ДНК из п
щевых продуктов,
проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анал
за продуктов ПЦР с помощью гель
электрофореза
Задачи:
определить присутствие генетически
модифицированного ра
с−
тительного сырья в
образцах
пищевых продукт
Достижения современной биотехнологии позволили выве
новы
сорт
сельскохозяйственных культур с полезными свойствами
устойчив
стью к вредит
елям и грибковым заражениям,
повыше
ной пищевой ценн
стью,
повышенной урожайностью, засухоустойчивостью и пр.
с помощью
генетических манипуляций, т. е. введением в геном растения генов, обесп
е−
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
чивающих соответствующий признак
или модификацией существующих
В обществе существуют как
сторонники
так и противники ген
модифицированных культур. Первые указывают на полезные свойства, кот
рые позволяют
интенсифицировать сельское хозяйство,
избежать использ
вания гербицидов, получать более высокие урожаи и т.
Вторые опасаются
проявлений аллергических реакций на такие продукты,
снижения природного
биоразнообразия, утечки трансгенов в дикую природу
других неопределе
ных
отдаленных во времени последствий
В настоящ
время
не обнаружено однозначных
доказательств, что г
е−
нетически модифицированн
продук
способны принести в
ред человеку.
Хотя выгода от применения ГМ
растений очевидна, существует много пр
тивников трансгенных растений, убежденных в их опасности и
использу
щих
в своих аргументах
невозмо
жность ученых дать полную гарантию без
пасности подобных продуктов
. В
каждой стране мира вопрос
об использов
а−
нии трансгенных растений
решается
разному
местными законодателями.
Примерно в 30 странах мира действует правило, согласно которому
упаковк
прод
уктов, при изготовлении которых использовались достижения
генной инженерии, должн
содержать информацию об этом, чтобы потреб
тели самостоятельно делали свой выбор. Однако во многих случаях,
например, когда соя используется при производстве мясных полуфабр
икатов,
производители н
е сообщают об этом покупателям.
1 июня 2004 г. в Российской Федерации установлен новый допуст
мый порог наличия таких примесей
0,9
%, который
требуется
количестве
но точно детектировать
и указывать на упаковке.
Генетически
модифи
цированные продукты абсолютно ничем не отл
чаются по внешнему виду от своих природных аналогов. Установить генет
ческую модификацию проще всего методами генетическ
го анализа, а име
но методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Если просто наличие
приме
сей (принцип да
нет) можно установить обычной ПЦР, то для к
личественной оценки примесей требуется более сложный метод ПЦР в р
е−
альном времени (ρeαl τiµe PCR). Последний получает все более широкое ра
с−
пространение, поскольку законодательство требует количест
венной марк
ровки присуствия ГМ
примесей в пищевых продуктах.
анализ основан на поиск
последовательностей, общих для бол
шинства генно
модифированных организмов. На
рис
схематически п
казано
как с помощью ПЦР проводится определение ГМО.
При этом используют специфические праймеры, которые комплеме
тарны характерным участкам в геноме
ГМО. Дело в том, что генетики и
с−
пользуют практически одни и те же регуляторные участки (промотор и те
ми
натор транскрипции) для контроля экспрессии вставленного гена.
Для получения ГМ
растений используют, как
правило
35S промотор
вируса мозаики цветной капусты
(CaMV)
который присутствует во всех и
вестных и выращиваемых в
промышленных масштабах ГМ
О и
ДНК
NOS
терминатора
T1 плазмиды
почвенной бактерии
Agrobacterium
tumefaciens
который также присутствует во многих промышленно
выращиваемых
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
растениях
В данной работе используются праймеры, комплементарные
именно этим последовательностям. Размеры ДНК, котор
ые при этом синт
е−
зируются
200 тыс. п.о. Цтобы проконтролировать, что экстрагированная из
тестового образца ДНК содержит гены растительных белков, в работе пред
смотрена контрольная ПЦР с растительным праймером к гену хлоропласта
PSII
Размер синтезируемого при этом фрагмента
455 тыс. п.о.
Рис. 2.
. Определение наличия ГМО в продуктах с помощью ПЦР
маркеры молекулярных весов
абор реагентов для проведения анализа GMO
Investiator kit #166
2500EDU
(BioRαd), включающий сертифицированный контрольный ГМО
отрицательный образец; контрольный ГМО
положительный образец; смесь
для проведения ПЦР
Mαστeρ µix; смесь ГМО праймеров; смесь Plαντ PSII
праймеров;набор маркерных ДНК; краситель для гелей Oρανge G;
орбент,
хелатирующий ионы Mg2+
InstaGene™ matrix
бразец продукта для исследования
абор пластиковой посуды:
микропробирки
5 мл, пробирки для ПЦР
0.2 мл
, наконечники для набора растворов, наконечники с фильтрами
омплект автоматических пипеток,
штативы
бокс для стерильных работ с УФ
рециркулятором производства
«Bio
an»
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
икроцентрифуга для пробирок Eππeνdoρφ 5417R c ротором для ми
ропробирок 1
мл (
см. работу 2.1
абораторный шейкер
вортекс Вортекс V
1 фирмы
BioSαν (см. раб
ту 2.1
радиентный т
ермоциклер
для
амплификации нуклеиновых кислот
«MJ
Miνi фирмы "Био
Рад" (СЧА)
радиентная
реал
тайм ПЦР система 
Chromo
 фирмы "Био
Рад"
(СЧА) для проведения ПЦР в реальном времени
борудование
для горизонтального гель
электорфореза
ДНК: и
сточник
постоянного тока
PowerPac HV Power Supply
Sub
Cell
камеры с з
а−
ливочным
столик
ами
«Bio
Rad»
(СЧА)
см. работу
одяная баня
термостат
фирмы BioSαν
см. работу 2.
истема
видео
документирования гелей
Molecular
Imager
Gel
Doc
производства
Bio
(СЧА)
с трансиллюминатором (
см. работу 2.1
Характеристика оборудования
бокс для стерильных работ с УФ
рециркулятором
UVC/T
«Biosan»
рис. 2.12
оборудованный открытой УФ
лампой и УФ
проточным
рециркулятором, предназначен
для стерильных работ, а также работ, чувс
вительных к РНК
и ДНК
контаминациям, напрмер, постановка реакций а
м−
плификации. Закрытый проточный УФ
рециркулятор позволяет осущест
лять
не только прямую УФ
обработку рабочей поверхности бок
са, но также
постоянную УФ
обработку воздушного пространства бок
са, что рекоменд
ется при работе с опасными ин
фекци
ными и вирусными материалами
Рис. 2.12.
нешний вид
бокс
для стерильны
х работ
с УФ
рециркулятором
фирмы 
BioSan
Технические характеристики
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Освещение и обеззараживание: 1 лампа дневного света 15Вт и УФ
лампа
Вт
без озона,
рециркулятор, состоящий из УФ
лампы
Вт,
вентилятора и антипылевого фильтра, заключенных в
специальный корпус
для защиты рабочей поверхности во время работы.
Длительный срок службы УФ ламп
до 8000 часов.
Автоматическое выключение УФ
ламп в случае открытия передней
дверцы
Цифровой таймер
на
1 мин
24 часа/постоянно
Масса
не
более
26 кг, внешни
е размеры
690x515x555 мм
Низкий уровень шума и энергопотребления.
Градиентный термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот
MJ MiνiCycleρ фирмы "Био
Рад"
рис. 2.13
является компактным перс
нальным 48
луночным прибором для амплификации нуклеиновых кислот
(ПЦР). Технология температурного градиента позволяет одновременно инк
бировать образцы при 8 различных температурах, что делает возможным о
тимизацию условий ПЦР за одну реакцию для достижен
максимальной
эффективности реакции и точности количественного определения. Блок для
образцов размером 6х8 может вмещать до 48 0,2 мл пробирок, стрипы,
луночные планшеты и до 12 0,5 мл пробирок:
Рис. 2.13.
нешний вид градиентного
ермоциклер
Mini
фирмы "Био
Рад"
Технические характеристики
Вмещаемое количество образцов: 48х0,2 мл пробирки, 0,2 мл
луночные планшеты, 6х8 0,2 мл стрипы или 12х0,5 мл пробирки.
Диапазон инкубационных температур 0
°С,
точность ±0,2
°С при
достижении программ
ируемой температуры в 90
°С.
Скорость изменения температуры до 2,5
°С в секунду.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Равномерность поддерживаемых температур не более ±0,4
°С между
лунками в пределах 10 с при программируемом достижении 90
°С.
Диапазон температурного градиента 35
°С с возмо
жными предел
а−
ми изменений 1
°С.
Точность поддержания температурного градиента ±0,4
°С между лу
ками одного ряда при достижении программируемой цели в конце ряда те
м−
ператур.
Равномерность поддерживаемых градиентных температур не более
±0,4
°С между
лунками одного ряда пределах 30 с при достижении целевой
температуры.
дисплей 64х128, 2
USB
входа.
Память на 400 типовых программ.
Градиентная реал
тайм ПЦР система 
Chromo
4 фирмы "Био
Рад"
рис. 2.14
предназначен
для амплификации ДНК с оценкой результатов в
реальном времени для количественного определения матриц с возможностью
детекции до
четыре
х мишеней в одном образце. Оптический детектор флю
ресцентных проб 
Chromo
4 установлен на базе г
радиентного термоциклера
Engine
PTC
200 с встроенным 96
луночным модулем для образцов.
Система укомплектована управляющим настольным компьютером
с интегрированным программным обеспечением для анализа результатов
и принтером
Рис. 2.14.
нешний в
ид градиентной
реал
тайм ПЦР систем
«Chromo4»
фирмы "Био
Рад"
для количественного определения молекул нуклеиновых кислот
в образцах
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Технические характеристики
Вмещаемое количество образцов: 96 штук 0,2 мл пробирок, один 0,2 мл
луночный планшет или 12
штук 0,2 мл 8
пробирочных стрипов с объемом
одного образца 10
100 мкл (20 мкл рекомендуется).
Диапазон инкубационных температур 0
105
°С, точность ±0,3
°С при
достижении программируемой температуры в 90
°С.
Скорость изменения температуры до 3
°С в секунду.
Равномерность поддерживаемых температур не более ±0,4
°С между
лунками в пределах 30 с при программируемом достижении 90
°С.
Диапазон температурного градиента 30
105
°С с возможными пред
е−
лами изменений 1
°С.
Точность поддержания температурного градиент
а ±0,4
°С между лу
ками одного ряда при достижении программируемой цели в конце ряда те
м−
ператур.
Равномерность поддерживаемых градиентных температур не более
±0,4
°С между лунками одного ряда
пределах 30 с при программируемом
достижении 90
°С.
Диапазон в
озбуждения флюоресценции: канал 1
450
490 нм, канал
500
535 нм, канал 3
585 нм,
канал 4
6500 нм.
Диапазон детекции флюоресценции: канал 1
515
530 нм, канал 2
560
580 нм, канал 3
610
650 нм,
канал 4
730 нм.
Память на 400 типовы
х программ.
Масса
12,6 кг.
Внимание!
Работы с генетическим материалом и при постановке ПЦР требуют
специальных условий:
1. Все работы проводятся в перчатках, спецодежде (лабораторные х
а−
латы).
2. В
лаборатории нельзя есть, пить, курить, разговаривать над откр
тыми пробирками.
3. До и после проведения работ необходимо тщательно вымыть руки
4. Обо всех нестандартных ситуациях необходимо немедленно увед
мить преподавателя.
Ход работы:
1. Подписать две
5 мл микропробирки 
non
ГМО и тест.
2. Отобрать 0,5
г 
non
ГМО образца, перенести в ступку, добавить
по 5 мл дистиллированной воды на каждый грамм образца.
3. Растереть образец пестиком в течение 2 мин до получения одноро
ной массы.
4. Добавить
еще 5 объемов воды и снова растереть массу пестиком.
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
5. В пробирку
ГМО внести 500 мкл
InstaGene™ matrix
и 50 мкл
полученной после растирания массы, закрыть пробирку.
6. Повторить
п.
4 для приготовления тестового образца.
7. В пробирку
тест внести
500 мкл
InstaGene™ matrix
и 50 мкл пол
ченной после растирания тестового образца массы, закрыть пробирку.
8. Тщательно перемешать пробирки на шейкере и поместить в водяную
баню на 95
°С на 5 мин.
9. Поместить пробирки в центрифугу и центрифугировать в теч
ение
5 мин на максимальной скорости. Супернатант содержит ДНК
экстракт.
10. Пронумеровать пробирки для ПЦР 1
6. Содержимое каждой пр
бирки указано в
табл
Таблица
Смесь реагентов для ПЦР
Master
мкл
растительной Мм (зеленая)
20 мкл, 
ГМО образец
мкл ГМО Мм (красная)
20 мкл, 
ГМО образец
мкл растительной Мм (зеленая)
20 мкл, тест образец
мкл ГМО Мм (красная)
20 мкл, тест образец
мкл растительной Мм (зеленая)
мкл, +ГМО образец
мкл ГМО Мм (красная)
20 мкл, +ГМО образец
11. Поместить все пробирки на лед.
12. В каждую пробирку поместить по 20 мкл соответствующей смеси
Master
mix
, каждый раз используя свежий наконечник.
13. Соответственно надписи внести
в пробирки образцы ДНК из п
(Осторожно! Нас интересует только супернатант!) и перемешать тщательно
пипетированием.
14.
ключить термоциклер по заданной программе (
таб
2.2
), после
нагрева термоблока до температуры
денатурации поставить прибор на паузу
и быстро поместить в него пробирки.
Таблица 2.
Чаг
Функция
Температура
Длительность
Цисло
циклов
Начальная ден
турация
Денатурация
2 мин
Амплификация
Денатурация
1мин
Отжиг
1мин
Синтез
2 мин
Завершающий
синтез
Синтез
(элогация цепи)
10 мин
Хранение
Хранение
неопределенное

МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Ход работы:
1. Приготовить 1
%
гель агарозы и
аппарат для гель
электрофореза
гласно протоколу из работы 2.1
задача 2.1.1.
Гель приготовить без бромист
го этидия.
2. Пробирки после ПЦР отцентрифугировать (пульс
режим).
3. В каждую пробирку внести по 10 мкл раствора красителя
Orange
тщательно перемешать на вортексе.
4. В лунки геля поместить по 20 мкл образцов в следующем порядке
табл
2.3
Таблица 2.3
Номер
лунки
бразец
non
ГМО образец, растительный праймер
non
ГМО образец, ГМО праймер
тест образец, растительный праймер
тест образец, ГМО праймер
+ГМО образец, растительн
й праймер
+ГМО образец ГМО праймер
абор стандартов мол. массы 100 βπ
5. Провести электрофорез на агарозном геле в
течение 30 мин при н
а−
пряжении 100
6. Зафиксировать результат на системе видеодокументации и проанал
зировать полученные результаты. Заполнить
табл
2.4.
Таблица 2.
Номер
полосы
Нанесенный образец
Наличие
полос
Размер
фрагментов
non
ГМО образец, растительный пра
мер
non
ГМО образец, ГМО праймер
тест образец, растительный праймер
тест образец, ГМО праймер
+ГМО образец, растительн
й праймер
+ГМО образец ГМО праймер
тандарты
мол. массы
МОДУЛЫ 2. СОВРЕМЕННЫ
Е УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: Т
РАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ
Сбвпуб 2.3. Лпмйшжтугжоопж прсжежмжойж рсйтфутугйя
ДНП
г рспефлубц р
йубойя нжупепн РЦС
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
1. Какие из молекул, содержащихся клетке, могут повлиять на выдел
е−
ние ДНК?
2. На каких принципах основан метод ПЦР?
3. Зачем нужны праймеры и как выбрать их последовательность?
4. Цто такое ГМО? Как вы относитесь к проблеме их
распростра
ения?
5. Возможно ли создание единой методики ПЦР с одинаковыми пра
мерами для определения всех видов ГМО?
5. Какие экспериментальные условия надо соблюдать при постановке
ПЦР? С чем это связано?
6. Цто такое
полимераза? Цто должно находитьс
я в реакционной
смеси для ее эффективной работы?
7. Как происходит разделение ДНК
фрагментов во время электро
фореза?
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель
освоение методов современной молекулярной диагностики
иммуноанализа и гибридизационного анализа, изучение возможностей и о
раничений каждого метода, соблюдение технологических требований к усл
виям проведения анализа.
Задачи:
ознако
мить с технологическими требованиями к условиям провед
е−
ния анализа биологических образцов
обучение технике экстракции генетического материала из биологич
ских образцов
обучение технике постановки полимеразной цепной реакции
освоение метода анализа
продуктов ПЦР с помощью гель
электрофореза
обучение технике постановки иммуноанализа (на примере
ELIZA
освоение колориметрического и биолюминесцентного вариантов и
м−
муноферментного анализа.
Развитие и достижения геномики человека обеспечили новые
возмо
ности для развития целого ряда других научных направлений. К настоящему
времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за б
лезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию,
муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшен
на, дистонию, гемофилию
А и В, фенилкетонурию, серповидно
клеточную анемию, талассемию, си
дром хрупкости Х
хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников
и др. Структуры этих генов расшифрованы и сами они клонированы. Это п
зволяет проводить эффекти
вную раннюю и даже пренатальную диагностику
и лечение. Тестирование будущих родителей на высокий риск генетического
заболевания теперь может проводиться для постоянно растущего числа г
нов. При этом типичным подходом является использование исследований
и помощи гибридизации или ПЦР
анализа. Можно протестировать здор
вого человека из семьи, где встречался, например, кистозный фиброз
и опр
делить, есть ли у него копия дефектного гена или нет. Если неблагополучн
го соче
тания генов избежать не удалось
и оба
потенциальных родителя я
ляются носителями рецессивного дефекта, они должны сами решать
риск
вать ли им, чтобы иметь детей. В любом случа
раннее начало профилакт
ческого лечения ребенка позволит предотвратить начало заболевания или
отодвинуть начало его
проявления. Сегодня в практику медико
генетического консультирования введены десятки систем для генодиагн
стики наиболее распространенных наследственных заболеваний. Устано
ленная последовательность генома поможет идентифицировать новые гены и
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
выявить сре
ди них те, что обусловливают предрасположенность к тем или
иным заболеваниям.
Успехи современной медицины в огромной мере зависят от того, уд
а−
стся ли вовремя обнаружить специфические инфекционные агенты (вирусы,
бактерии, паразитические микроорганизмы) или
изменения в содержании
важных биологически активных белков или низкомолекулярных соединений
в организме. Надо ли говорить, что профилактику и лечение любого забол
е−
вания существенно облегчает ранняя и точная диагностика. Современные м
е−
тоды молекулярной диа
гностики обладают высокой специфичностью и чу
ствительностью и при этом являются достаточно продуктивными, эффекти
ными и недорогими для рутинного применения.
Цель работы:
знакомство с процедурой проведения твердофазного
иммуноферментного анализа, демонстрация использования в качестве метки
генетически слитого бифункционального химерного белка,
обладающего
биолюминесцентной активностью Са2+
активируемого фотопротеина обел
на и иммуноглобулин
связывающей способностью бе
лка А из Sταπhylococcuσ
aureus.
Материалы и оборудование:
0,1М фосфатный буфер, содержащий 0,9
% NaCl (PBS)
1% р
р бычьего
сывороточного альбумина (БСА) в PBS
астворы иммуноглобулинов класса
G кролика, мыши и человека
(RIgG, MIgG, HIgG), в PBS, 10
мкг/мл
аствор для помывки планшетов (PBS, содержащий 0, 05
% Tween
20 и
5мМ ЭДТА)
епрозрачные планшеты для иммунологического
микроанализа
аствор химерного белка с активностью 500 мV/мл
ланшетный люминометр Luµiνoσcαν v1.30
абор автоматических пипеток и наконечники к ним
Микропланшетный люминометр Luµiνoσcαν v1.30 (
ThermoElectron
Финляндия)
рис. 3.1
. Прибор предназначен для измерения люминесцентн
го сигнала от растворов в лунках микропланшет для иммуноферментного
анализа
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Сбвпуб 3.1. ВИПМЮНИОЕТЦЕОУОЫК УГЕСЕПХБИОЫК ИННФОПХЕСНЕОУОЫК БОБМИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Рис. 3.1.
Внешний вид микропланшетн
люминометр
Luminoscan
ThermoElectron
, Финляндия)
Технические характеристики
Диапазон измерений
270
670 нм
Люминометрический диапазон
до 5000 относительных световых
единиц
Цувствительность
1 фмол АТФ
Люминометрический динамический диапазон
9 порядков
Прибор
оснащен орбитальным шейкером, что позволяет проводить и
кубирование планшет при перешивании, скорость вращения 60
1200
rpm
диаметр
мм.
Прибор позволяет производить измерения при термостатировании
в температурном режиме от 25 до 37
С.
оснащен си
стемой впрыска ре
а−
гентов
диспенсером с объемом от 1 до 1000
мкл с разрешением 1 мкл
Имеется возможность производить измерения как в стандартном 96
луночном микропланшете, так и других, от 6 до 384
луночных планшетах.
Для коммуникации через
PC
прибор укомплектован соответствующим
программным обеспечением.
Наличие шейкера
орбитальный, скорость 60
1200
rpm
Температурный режим
Наличие диспенсера
1, 1
1000мкл, с разрешением 1 мкл
Ход работы:
1. В лунки с координатами А2
F12 (все
го 66 лунок) планшета для и
м−
муноферментног
о анализа внести по 100 мкл PBS.
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Сбвпуб 3.1. ВИПМЮНИОЕТЦЕОУОЫК УГЕСЕПХБИОЫК ИННФОПХЕСНЕОУОЫК БОБМИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
2. В лунки А1,В1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов кр
лика; в лунки С1,D1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов мыши; в
лунки E1,F1 внести по 200 мкл раствора иммуно
глобулинов человека (ко
центрации растворов иммуноглобулинов
5 мкг/мл)
3. В каждом ряду раститровать растворы иммуноглобулинов с шагом 2.
Последние
две
лунки каждого ряда оставить с PBS для контроля
4. Для эффективной сорбции планшет выдержать при 37
°С в течение
часа либо при 4 °
С в течение ночи
5. Удалить содержимое лунок и промыть их раствором для промывки
трижды
6. В каждую лунку внести по 120 мкл раствора БСА и проинкубир
вать планшет при 37
С в течение часа.
7. Промыть планшет
так,
как описа
но в п.
8. В каждую лунку внести по 100 мкл раствора химерного белка и пр
инкубировать планшет при комнатной температуре в течение часа
9. Промыть планшет
так,
как описано в п.
10. Провести измерения биолюминесценции сорбированного химерн
го белка с
помощью планшетного люминометра Luµiνoσcαν v1.30
11. Построить зависимость люминесцентного сигнала от концентрации
каждого из иммуноглобулинов, усредняя соответствующие сигналы и выч
тая сигнал в контрольной лунке.
1. На чем основан иммуноферм
ентный анализ?
2. За счет чего происходит сорбция иммуноглобулинов? Как еще мо
но проводить первичную сорбцию?
Для чего проводится обработка поверхности лунок раствором БСА
(п.6)?
За счет чего происходит сорбция химерного белка? Обоснуйте ответ.
5.
Как меняется величина биолюминесцентного ответа от происхожд
е−
ния иммуноглобулинов? За счет чего?
Цель работы
: знакомство с построением и процедурой твердофазного
иммуноферментного
анализа, получение экспериментальных навыков для
проведения аналитического исследования на базе взаимодействия антиген
антитело.
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Сбвпуб 3.1. ВИПМЮНИОЕТЦЕОУОЫК УГЕСЕПХБИОЫК ИННФОПХЕСНЕОУОЫК БОБМИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Анализ биологических образцов, построенный на базе взаимодействия
антиген
антитело, называется иммуноанализом. На сегодня иммун
оаналит
ческие системы являются наиболее широко распростране
ными диагност
ческими инструментами. Одн
из разновидност
ей
иммуноанализа
так наз
ваемая
ELIZA
, си
тема названная по первым буквам английского обознач
ния:
enzyme
linked
immunosorbent
assay
(фе
рмент
связанный твердофазный
иммуноанализ)
Специфичность этого анализа обусловлена высокой аффи
ностью взаимодействия антиген
антитело. Наличие этого взаимодействия
определяют с помощью фермента, который присоединяется к иммуноглоб
лину. При добавлении к
этому комплексу субстрата данного фермента разв
вается реакция, продукт которой обладает определенной визуальной хара
теристикой
например, окраской или свечением. По количеству продукта
(интенсивности окраски или свечения) судят о количестве антигена
рис. 3.2
показан
последовательность операций
проводимых при имм
ноферментном анализе: на поверхности иммунологической лунки иммобил
зуется искомый антиген и другие белки (
аг 1), затем вносится р
аствор пе
вичного антитела к данному антигену (
аг 2), после инкубирования и пр
мывок вносится вторичное антитело, помеченное ферментом (
аг 3), после
инкубирования и промывок в лунки вносят субстрат фермента
который
при взаимодействии с ферментом дает ок
рашенный продукт (
аг 4).
Окр
а−
шивание раствора происходит только в тех лунках, куда вносили образцы,
содержащие искомый
антиген (
рис. 3.

Рис.
. Последовательность операций при проведении
ELIZA
Рис.
. Так выглядит результат
ELIZA
Современный рынок предлагает иммунодиагностикумы для определ
е−
ния чрезвычайно широкого спектра молекул
от инфекционных агентов до
токсинов, гормонов и т.
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Сбвпуб 3.1. ВИПМЮНИОЕТЦЕОУОЫК УГЕСЕПХБИОЫК ИННФОПХЕСНЕОУОЫК БОБМИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Для выполнения работы используется
икропланшетный денситометр
Model
680 ("
BioRad
", СЧА)
рис.
). Прибор предназначен для измерения
оптической плотности растворов в лунках микропланшет для
иммунофе
ментного анализа
Рис. 3.4.
Внешний вид микропланшетного денситометра
Model
680 ("
BioRad
", СЧА)
Технические характеристики
Диапазон
измерений
400
750 нм
Фотометрический диапазон
000
3,5 ОД
Линейность
% в диапазоне 0,000
2,000; ±
% в диапазоне
2,000
3,000
Погрешность
% или 0,01 ОД в диапазоне 0,000
3,000 на 490 нм
К прибору прилагаются 8 оптических фильтров.
Время считывания
6 с на одной длине волны, 10 с на двух длинах
волн
Прибор оснащен жидкокристаллическим дисплее
м, имеются опции
встроенного хранения стандартных кривых и графиков и интерфейс к друг
му принтеру. Результаты измерений выдаются с помощью встроенного при
тера на термической ленте.
В рамках данной работы предлагается провести иммуноанализ на пр
сутствие
модельного антигена в данных биологических образцах с помощью
ELIZA
. Образцам будут присвоены имена
и часть из них будет смешана с
другими. Таким образом будет смоделировано распространение модельной
контактной инфекции среди близкой группы людей. Это ра
спространение
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Сбвпуб 3.1. ВИПМЮНИОЕТЦЕОУОЫК УГЕСЕПХБИОЫК ИННФОПХЕСНЕОУОЫК БОБМИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
должно быть обнаружено по результатам проведенного анализа
ELIZA
. Р
е−
портерным ферментом
используемым в работе
является пероксидаза хрена.
Материалы и оборудование
абор реагентов для проведения анализа
ELIZA
Immuno
Explorer
Kit
166
2400
BioRad
), включающий:
образец антигена (положительный контроль)
образец первичных антител (ПА)
образец вторичных антител, меченых пероксидазой хрена (
HRP
(ВА)
раствор субстрата пероксидазы
(тетраметилбензидина,
TMB
кратный раствор фосфатного буфера и
NaCl
PBS
% раствор
Tween
абор пластиковой посуды: пробирки Eππeνdoρφ (1,5 мл), наконечники
для набора растворов, резервуары для промывочных растворов
омплект автоматических пипеток, штативы
ммунологическ
ие планшеты стандартного или стрипового типа
(12
луночные)
умажные полотенца
икропланшетный денситометр
Model
680 (
BioRad
Ход работы
1. Каждый студент получает образец
своей биологической жидкости
Таблица
Образцы для проведения анализа
ELIZA
Immuno
Explorer
Kit
EDU
BioRad
робирка
писание
бозначение
одержание
Фиолетовая
Положительный контоль
0,5 мл
Синяя
Отрицательный контроль
0,5 мл
Зеленая
Первичные антитела
1,5 мл
Оранжевая
Вторичные антитела
1,5 мл
Коричневая
Субстрат для
HRP
Суб
1,5 мл
Еелтая
инфицированный
субъект
Еелтая
Не инфицированный
субъект
2.
Цасть студентов по указанию преподавателя смешивают свой
образец с другим студентом
получается образец Х
. Образцы
хранить
при
4 °С.
3.
Подписать лунки стрипа, как показано на
рис
. 3.5.
4.
В каждую лунку внести по 50 мкл соответствующего раствора. (И
с−
пользуйте только свежие носики!)
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Сбвпуб 3.1. ВИПМЮНИОЕТЦЕОУОЫК УГЕСЕПХБИОЫК ИННФОПХЕСНЕОУОЫК БОБМИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
5.
Инкубировать 5 мин при комнатной температуре, затем промыть
трижды.
Рис. 3.5
6.
Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ПА
инкубировать 5
мин при комнатной температуре.
7.
Промыть трижды
8.
Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ВА
инкубировать 5 мин при комнатной
температуре
9.
Промыть трижды
10.
Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ВА
инкубировать 5 мин при комнатной температуре
11.
Наблюдать полученный результат и, заполнив таблицу, проследить
распространение условной инфекции при контакта
х внутри замкнутой поп
ляции
Таблица
Результаты работы
Имя студента
Полученный
образец (+) или (
Наличие контактов
1.
Как иммунная система защищает организм от инфекций?
2.
Почему при пересадке органов необходимо принимать
иммунос
прессанты?
3.
Для чего служит
ELIZA
4.
Почему и как работают репортерные ферменты?
5.
Зачем необходимы положительный и отрицательный контроли?
6.
Зачем проводят тщательные промывки лунок после каждой стадии?
7.
Если получен негативный ответ по
результатам иммуноанализа, о
начает ли это на 100
% отсутствие заболевания?
Какой иммунотест можно купить в любой аптеке?
МОДУЛЫ 3. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЮРНО
И ДИАГНОСТИКИ
Сбвпуб 3.1. ВИПМЮНИОЕТЦЕОУОЫК УГЕСЕПХБИОЫК ИННФОПХЕСНЕОУОЫК БОБМИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель работы
: знакомство с постановкой процедуры генотипирования
на основе вариабельности длины участков коротких тандемных повторов
STR
, овладение навыками постановки и проведения полимеразной цепной
реакции (ПЦР) и анализа продуктов ПЦР с помощью гель
электрофорез
а.
На сегодня наиболее надежным методом идентификации человека я
ляется метод отпечатка ДНК (
profil
молекулярно
биологически
е−
тод, определяющий генотип данного образца ДНК и однозначно устанавл
вающий его принадлежность (или ея отсутствие) данном
у индивидууму. Этот
подход используется в судебной экспертизе, при поиске людей, массовых к
а−
тастрофах, установление родителей и пр. Какого типа ДНК последовательн
сти можно использовать для этих целей? Известно, что ДНК человека соде
жит 3 миллиарда п.о.,
99,5
% из которых являются общими для всех людей.
Оставшиеся 0,5
% содержат различия, и именно эти
полиморфные
участки
используются для идентификации (генотипирования), в том числе в судебной
экспертизе. По всеобщему соглашению используются некодирующие по
сл
е−
довательности ДНК
расположенные в разных участках хромосом (локусы).
Для судебной экспертизы используются некодирующие последовательности
ДНК, содержащие так
азываемые участки коротких тандемных повторов
STR, от английского словосочетания σhoρτ τανd
em repeats.
STR
представляют
собой короткие последовательности ДНК (2, 3, 4, иногда 6, 8 нуклеотидов),
которые многократно повторяются в 5’
→3’ направлении
. На
рис. 3.
пок
азан
локус, известный как
ТН01, реально использующийся для генотипирования.
Его
ДНК содержит 4 повтора [ТСАТ]:
Рис.
. Нуклеотидная последовательность ТН01 локуса
Для этого ТН01
STR
локуса существуют более 20 альтернативных
форм (аллелей), найденных у людей по всему миру, к
оторые различаются к
личеством повторов [ТСАТ]. Однако у каждого человека имеется только
два
аллеля
один унаследован от отца, другой от матери. Для получения ДНК
отпечатка исследуемый образец ДНК амплифицируют с помощью ПЦР, с
использованием специфически
х праймеров, последовательность которых
комплементарна последовательностям с обеих сторон локусов
и получают
миллионы копий двух оригинальных аллелей. Эти копии содержат то же с
а−
МОДУЛЫ 3.
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ М
ОЛЕКУЛЮРНОИ ДИАГНОСТ
ИКИ
Сбвпуб 3.2. ИЕЕОУИХИЛБЦИа ИОЕИГИЕФФНБ Т РПНПЩЭЮ ДЕОПУИРИСПГБОИа
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
мое число
STR
повторов, что и исходный образец ДНК
и разделяются по
размеру
с помощью гель
электрофореза. Полученный набор полос является
индивидуальной характеристикой индивидуума. Для дискриминации (и
с−
ключения персоны из числа подозреваемых, например) одного локуса недо
таточно.
Он может определить разницу между 1000 людьми,
два
локуса
между 10
000, в обычной практике пользуются результатами генотипиров
а−
ния по
трем
пяти
локусам.
На
рис.
показано
как,
используя генотипир
вание сразу по
тре
м локусам (
3,
1358
17 и
FGA
23)
из
13 возможных лиц (обозначены звездочками) можно идентифицировать
только одно
В настоящее время существует несколько баз данных по ДНК
типированию
Одной из наиболее обширн
является база данных америка
ского федерального б
юро расследований (организована в 1998 г.), в которой
собраны данные о проходящих по криминальным делам и осужденных лиц,
ак
наз
ываемая
база
CODIS
COmbined
Index
System
). В ней хранятся
данные, полученные по генотипированию с использованием 13 локусо
Рис. 3.
. Увеличение количества локусов
использованных при генотипировании
повышает вероятность идентификации индивидуума
TH01 генотип 6
D3S135
8 генотип 16
генотип 21
В рамках работы планиру
тся следующ
рядок
операций: 1) пров
е−
дение ПЦР предложенных образцов ДНК (один из них принадлежит неи
вестному Х и получен с условного места преступления, остальные прина
лежат условным подозреваемым лицам А
Г) с определенными парами пра
меров; 2) разделение полученных ДНК
по молекулярной массе с помощью
гель
электрофореза; 3) определение размеров полученных ДНК с помощью
набора стандартных ДНК и сопоставление состава ДНК
фрагментов в пол
ченных образцах для идентификации неизвестной ДНК.
МОДУЛЫ 3.
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ М
ОЛЕКУЛЮРНОИ ДИАГНОСТ
ИКИ
Сбвпуб 3.2. ИЕЕОУИХИЛБЦИа ИОЕИГИЕФФНБ Т РПНПЩЭЮ ДЕОПУИРИСПГБОИа
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
абор
реагентов для проведения анализа Cρiµe Sceνe Iνveστigατoρ
PCR
Basics
Kit
Catalog
#166
2600
BioRad
),
включающий
5 образцов ДНК;
смесь для проведения ПЦР
Master mix;
набор праймеров для генотипирования по локусу
BXP
007;
набор маркерных аллельных
ДНК;
краситель для гелей Oρανge G;
абор пластиковой посуды: пробир
ки Eππeνdoρφ (1,5 мл), пробирки
для
ПЦР, наконечники для набора растворов, наконечники с фильтрами
омплект автоматических пипеток, штативы
одяная баня
икроцентрифуга
модель 5417
pendorf
СЧА)
ермоциклер MJ MiνiCycleρ (
Био
Рад
("Био
Рад", СЧА)
еактивы и оборудование для проведения гель
электрофореза: горизо
тальная камера с подносом для заливки геля и гребенки, генератор постоя
ного тока, агароза, ТАЕ
буфер
ерсональный
термоциклер
MJ MiνiCycleρ ("Био
Рад", СЧА)
ентрифуга
модель 5417
Eppendorf
СЧА)
омплект, состоящий из
горизонтальн
камер
с подносом для зали
ки геля
Mini
Sub
cell
Bio
Rad
, СЧА)
и гребенки, генератор
постоянного
тока
PowerPac
Bio
, СЧА)
Внимание!
Работы с генетическим материалом и при постановке ПЦР требуют
специальных условий:
1. Все работы проводятся в перчатках, спецодежде (лабораторные х
а−
латы) и очках
2. В
лаборатории нельзя есть, пить, курить, наносить косметику
3. До и после проведения работ необходимо тщательно вымыть руки
4. Обо всех нестандартных ситуациях необходимо немедленно увед
мить преподавателя.
Ход работы:
1.
Подписать 5 пробирок для ПЦР: Х, А, Б, В, Г
2.
Внести в пробирки ДНК и смесь Mαστeρ µix + прамеры по
табл
при этом каждый забор производить свежим носиком с фильтром и сразу з
а−
крывать пробирки.
МОДУЛЫ 3.
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ М
ОЛЕКУЛЮРНОИ ДИАГНОСТ
ИКИ
Сбвпуб 3.2. ИЕЕОУИХИЛБЦИа ИОЕИГИЕФФНБ Т РПНПЩЭЮ ДЕОПУИРИСПГБОИа
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Таблица
бозначение
матрица
Mαστeρ µix + прамеры
Х + имя студента
20 мкл, Х
20 мкл
А + имя студента
20 мкл, А
20 мкл
Б + имя студента
20 мкл, Б
20 мкл
В + имя студента
20 мкл, В
20 мкл
Г + имя студента
20 мкл, Г
20 мкл
Поместить пробирки в
термоциклер и включить прибор по заданной
программе
табл
Таблица 3.
Чаг
Функция
Температура
Длительность
Цисло
циклов
Начальная
денатурация
Денатурация
2 мин
Амплификация
Денатурация
30 сек
Отжиг
30 сек
Удлинение
1 мин
Финальное
удлинение
Удлинение
10 мин
Хранение
Хранение
неопределенное
Ход работы:
1.
Приготовить аппарат для гель
электрофореза по
инструкции к пр
бору
2.
Пробирки после ПЦР отцентрифугировать (пульс
режим)
3.
В каждую пробирку внести по 10 мкл раствора красителя
Orange
пользуясь
каждый раз свежим носиком
и тщательно перемешивая.
4.
В лунки геля поместить по 20 мкл образцов в
следующем порядке
табл

МОДУЛЫ 3.
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ М
ОЛЕКУЛЮРНОИ ДИАГНОСТ
ИКИ
Сбвпуб 3.2. ИЕЕОУИХИЛБЦИа ИОЕИГИЕФФНБ Т РПНПЩЭЮ ДЕОПУИРИСПГБОИа
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Таблица 3.
Номер
лунки
Образец
Набор стандартов мол. массы
5.
Провести электрофорез на агарозном геле в течение 30 мин при н
а−
пряжении 100
6.
Окрасить гель и
проанализировать полученные результаты.
1. Какие образцы пригодны для проведения ДНК
анализа?
2. Зачем мы использовали ПЦР?
3. Какая разница между аллелем и локусом?
4. Почему для ДНК
типирования ( в частности, в судебной экспертизе)
используют
ДНК некодирующих участков генома?
5. Цто такое
Master
mix
и для чего нужен каждый из ея компонентов?
6. Какие стадии включает ПЦР и что происходит на каждой из них?
7. Как происходит визуализация материала после проведения гель
электрофореза?
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн


4
4
.
.










.
.










Цель раздела:
ознакомить с микроклональным размножением раст
е−
ний и направлениями его использования, объяснить механизмы процессов,
протекающих при размножении в культуре тканей растений.
Задачи раздела:
ознакомление с видами и способами выделения эксплантов для пр
ведения микроклонального размножения;
освоение техники этапов и способов микроклонального размножения;
определение
роли фитогормонов в процессе микроразмножения на
разных его этапах;
управление возможностями увеличения коэффициента размножения
растений.
Объект:
декоративные и сельскохозяйственные растения
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созда
нию
принципиально нового метода вегетативного размножения растений
нального микроразмножения (получение в условиях
in vitro
, неполовым п
тем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе м
е−
тода лежит уникальная способность раститель
ной клетки реализовывать пр
сущую ей тотипотентность (свойство соматических клеток растений полн
стью реализовать свой генетический потенциал развития с образованием ц
е−
лого организма), то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало
целому растит
ельному организму.
Процесс клонального микроразмножения состоит из четырех этапов:
выбор растения
донора, изолирование эксплантов (ткань, взятая из своего
оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и по
держания ее жизнедеятель
ности) и получение хорошо растущей стерильной
культуры; 2
собственно микроразмножение, когда достигается получение
максимального количества микропобегов (или мериклонов
клон
, получе
ный из меристемной культуры); 3
укоренение размноженных побегов с п
следующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости
депонирование растений
регенерантов при пониженной температуре
С); 4
выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к
реализации или посадке в поле.
Клон
популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или
группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой
произошли из одной повторно культивируемой клетки.
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн


















Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется
применение определенного состава питательной среды.
На 1
м этапе
введение в культуру
) необходимо добиться получения
хорошо растущей стерильной культуры, что осуществляется путем стерил
заци
и растительных тканей, их тщательной промывки в стерильной дисти
лированной воде и перенесения на приготовленную стерильную питательную
среду. На этом этапе, как правило, используют среду, содержащую мин
е−
ральные соли по рецепту Мурасиге и Скуга (
табл. 4.1
, а также разли
ные биологически активные вещества и стимуляторы роста: ауксины (прои
водные индола, образующиеся в апикальных меристемах и стимулирующие
клеточное растяжение) и цитокинины (производные 6
аминопурина, индуц
рующие в присутствии ауксина деление клеток и дифференцировку стебл
вых почек у каллусов, активирующие рост клеток листа)
в различных соч
е−
таниях в зависимости от объекта (работа 4.1).
Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 мес., в
зультате которого наблюдаются рост меристематических тканей и форм
рование первичных побегов.
На 2
м этапе
(собственно размножение, субкультивирование) необх
димо получить максимальное количество микропобегов. Как и на 1
м этапе,
используют питательную сре
ду по рецепту Мурасиге и Скуга. Основную
роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют
соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и
ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях
1 до 10 мг/л, а из ауксинов
ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.
Наиболее трудоемкими являются 3
й и 4
й этапы, от которых зависит
успех клонального микроразмножения.
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГ
ИЮ МИКРОКЛОНАЛЫНОГО
РАЗМНОЕЕНИЮ
Ужцойлб лфмэуйгйспгбойя й ибебшй сбиоьц юубрпг нйлсплмпобмэопдп сбинопзжо
йя сбтужойк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Таблица 4.1
Составы наиболее употребляемых питательных сред
Составные
компоненты
Концентрация компонентов в среде, мг/л
Уайта
Нича
(Chu)
Неорганические вещества
СаС1
х2Н
СаС1
-

-

-

166
-

MgSO
х7 H
(NH
Ca(NO
х4 H

300
-

-

-

-

NaH
KC1
MnSO
х4 H
MnSO
х H

-

-

10
-

3,3
ZnSO
х7 H
NaMoO
х2
MoO
CuS0
х5H

0,01
0,025
0,025
0,025
-

CoCl
х6H

-

0,025
0,025
-

-

Fe(SO
FeSO
х7 H

-

27,8
27,8
27,8
27,8
ЭДТАх2 H

-

37,3
37,3
37,3
37,3
Органические вещества
Никотиновая кислота
Пиридоксин гидрохлорид
Тиамин гидрохлорид
Биотин
Инозит
Глицин
Фолиевая кислота
Сахароза
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГ
ИЮ МИКРОКЛОНАЛЫНОГО
РАЗМНОЕЕНИЮ
Ужцойлб лфмэуйгйспгбойя й ибебшй сбиоьц юубрпг нйлсплмпобмэопдп сбинопзжо
йя сбтужойк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
На 3
м этапе
(укоренение)
, как правило, меняют основной состав ср
е−
ды: уменьшают в 2, а иногда и в 4 раза концентрацию минеральных солей по
рецепту Мурасиге и Скуга или заменяют ее средой Уайта (
табл. 4.1
), умен
шают количество сахара до 0,5
% и полностью исключают цитокинины,
оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования и
с−
пользуют
индолил
масляную кислоту (ИМК),
нафтил
уксусную кисл
ту (НУК) и чаще
индолил
уксусную ИУК. В последнее время предложен
метод укорен
ения пробирочных растений
в условиях гидропоники
(выращивание растений без почвы на искусственных средах с использован
ем питательного раствора). Он позволяет значительно упростить этап укор
е−
нения и одновременно получать растения, адаптированные к естест
венным
условиям.
Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной мат
е−
рией или добавление в питательную среду активированного угля способс
т укоренению микропобегов.
й этап
адаптация к грунту
Пересадка растений
регенерантов в
субстрат яв
ляется ответственным этапом, завершающим процесс клональн
го микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки проб
рочных растений
весна или начало лета. Растения с 2
5 листьями и хорошо
развитой корневой системой осторожно вынимают из колб и
ли пробирок
пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают
от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно пр
стерилизованный при 85
°С в течение 1
2 ч. Для большинства растений в
качестве субстратов используют т
орф, песок (3:1), торф, дерновую почву,
перлит (измельченная горная порода вулканического происхождения) (1:1:1),
торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют орхидные, для которых
готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев б
ука
или дуба, сосновой коры (1:1:1). Приготовленным заранее почвенным су
стратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых
выращивают растения
регенеранты. Горшочки с растениями помещают в т
е−
плицы с регулируемым температурным режимом (2
°С), освещенностью
(не более 5 тыс. лк) и влажностью (65
%).
Церез 20
30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения по
кармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасиге и Скуга,
Цеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или
комплексным мин
е−
ральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие
емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизир
ванных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для к
а−
ждого индивидуального вида растений.
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГ
ИЮ МИКРОКЛОНАЛЫНОГО
РАЗМНОЕЕНИЮ
Ужцойлб лфмэуйгйспгбойя й ибебшй сбиоьц юубрпг нйлсплмпобмэопдп сбинопзжо
йя сбтужойк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн




Культивирование изолированных тканей растений на всех этапах пр
исходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты, где
культивирование проводится в пробирках или других сосудах, должна с
ставлять в зависимости от
культуры 1000
000 лк. Необходимо учитывать
фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.
Влажность в световой комнате должна быть 60
%. Более сухой во
дух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, ос
бенно есл
и они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а
значит
и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в
комнате можно использовать поддоны с водой.
Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей
°С, для ку
льтуры тканей тропических растений
°С. В случае
индукции морфогенеза температуру понижают до 18
°С.
Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят
от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптимал
ной влажнос
ти можно создать с помощью климатических камер.
Существует несколько способов клонального микроразмножения. Ра
личные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий
культивирования эксплантов на проце
ссы морфогенеза, наблюдали разные
ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания,
что, в свою очередь, привело к созданию новых классификаций методов кл
нального микроразмножения.
Исходя из предложенных в литературе путей микроразмноже
ния ра
с−
тений, этот процесс можно осуществлять следующими четырьмя методами:
активацией развития уже существующих в растении меристем (обр
а−
зовательная ткань растений, долго сохраняющая способность к делению и
возникновению новых клеток, отличается высокой
метаболической активн
стью) (см.
работы 4.1
. и
4.3
);
индукцией возникновения адвентивных почек (развитие почек из н
е−
обычных точек происхожд
ения, например, почечные или корневые ткани,
возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источн
ков, а не из зигот) непосредственно на тканях экспланта (см.
работу 4.2
индукцией соматического эмбриогенеза (образование эмбриоидов
зародышеподобных структур, возникающих путем соматического эмбриог
е−
неза в культурах клеток и тканей, напоминающ
его
нормальный зиготический
эмбриогенез);
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГ
ИЮ МИКРОКЛОНАЛЫНОГО
РАЗМНОЕЕНИЮ
Ужцойлб лфмэуйгйспгбойя й ибебшй сбиоьц юубрпг нйлсплмпобмэопдп сбинопзжо
йя сбтужойк
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
дифференциацией адвентивных почек в пер
вичной и пересадочной
каллусной ткани (неорганизованная, пролиферирующая масса дедиффере
цированных растительных клеток).
Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в
тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем после
ний способ менее пригоден при клональном микроразмножении,
поскольку
посадочный материал, полученный таким методом, может быть генетически
нестабилен по отношению к растению
донору. Основное отличие образов
а−
ния зародышей
in
vitro
(в стекле) от
in
vivo
(в е
стественных условиях) закл
чается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зар
дышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные
структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных м
е−
ристем (недифференцированн
ая ткань, локализованная в пределах верхушки
побега или кончика корня, представляющая собой куполоподобную структ
ру) стебля и корня.
Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа.
На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за сче
т добавления в
питательную среду ауксинов, как правило, 2,4
дихлорфеноксиуксусной к
слоты (2,4
Д) и превращаются в эмбриональные клетки. Для формирования
эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью
его исключать из состава питательно
й среды. Как правило, соматический э
м−
бриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой п
тательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией.
Этот метод микроразмножения имеет свои преимущества, связанные с
сокращением пос
леднего (третьего) этапа клонального микроразмножения
(требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации проб
рочных растений), потому что соматические зародыши представляют собой
полностью сформированные растеньица. При использовании соответст
щей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать и
с−
кусственные семена.
Цель работы:
своение приемов проведения 1
этапа микроразмн
жения в культуре изолированных тканей. Определение условий, необход
мых для проведения следующих этапов микроразмножения (формирования
проростков или каллуса в
культуре изолированных зародышей).
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.1. ТСБГОЕОИЕ ЭХХЕЛУИГОПТУИ СБИОЫЦ РИУБУЕМЭОЫЦ ТСЕЕ РСИ ЛФМЭУИГИСПГБОИИ ИИПМИСПГБООЫЦ УЛБОЕК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Культура изолированных зародышей используется в экспериментах
для доращивания зародышей, обреченных на гибель в естественных услов
ях: при проращивании недозрелых семян, для снятия периода их покоя, в и
с−
следованиях по
отдаленной гибридизации; для проращивания гаплоидных
(имеющих один набор хромосом) зародышей культурного ячменя и т.
Во многих комбинациях межвидовых и межродовых скрещиваний гибри
ные зародыши гибнут на ранних стадиях развития, поэтому их необходимо
св
оевременно вычленять из семян и проращивать на искусственной пит
а−
тельной среде для сохранения ценных генотипов.
Зародыши эффективнее проращивать на агаризованной, а не на жидкой
среде. В качестве питательных сред для зародышей используют среды
табл. 4.1
) и другие. Наиболее подходящий энергетический источник
сахароза. Для зародышей злаков и их гибридов
беру
т концентраци
сахар
зы не менее 30 г/л. В зависимости от степени дифференцированности зар
дышей используют фит
огормональные и другие добавки, в качестве которых
применяют цитокинины, ауксины, витамины и аминокислоты.
Материалы и оборудование:
релые колосья или зерна ячменя или пшеницы, замоченные в воде
за 1 стуки до выполнения работы
робирки со стерильной пит
ательной средой, приготовленные в р
зультате выполнения предыдущей работы 1.2
терильные пинцеты, скальпели
ашки Петри
таканы со стерильной водой.
Ход работы:
1. Зерновки ячменя или пшеницы в обычных условиях предварительно
стерилизуют спиртом в
течение 2
3 мин, с зародыша снимают защитную
пленку, покрывающую зерно. Необходимое для эксперимента количество
зерновок одного образца помещают в марлевые упаковки, куда кладут н
е−
большие листки (1 см
) с указанием генотипа донорного растения, и скре
ляют
их шпагатом.
2. В условиях бокса стерилизуют упаковки в растворе диацида (токс
ческое вещество) 10 мин, потом трехкратно промывают в стаканах со ст
е−
рильной водой и переносят в чашки Петри.
3. Пинцетом и скальпелем раскрывают упаковку и раскладывают зе
вки на марлю, перевернув их бороздкой вниз и, придерживая пинцетом,
скальпелем рассекают (если она не удалена) оболочку и выделяют зародыш,
стараясь его не повредить.
4. Зародыш переносят в пробирку с питательной средой, располагая его
щитком вниз.
5. Используют
три
варианта среды:
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.1. ТСБГОЕОИЕ ЭХХЕЛУИГОПТУИ СБИОЫЦ РИУБУЕМЭОЫЦ ТСЕЕ РСИ ЛФМЭУИГИСПГБОИИ ИИПМИСПГБООЫЦ УЛБОЕК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
+ 2,4
Д (1 мг/л) и ИУК (2 мг/л );
или
6. Культуральные пробирки закрывают фольгой. На каждой пробирке
отмечают дату введения и шифр вводимого в культуру генотипа. Культив
рование осуществляют при 22
С, 16
часовом световом дне и освещенн
сти 1000 л
7. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована записью в
журнале после введения экспланта донорного растения в культуру, а затем
при проведении наблюдений и пассажах (перенос или пересадка клеток
из
одной культуральной емкости в другую) на свежие питательные среды дол
ны быть отражены все изменения.
8. Оформить
табл
4.2
и заполнить эту таблицу после окончания ман
пуляций в ламинар
боксе (первые 4 графы). Количество ст
рок соответствует
введенным в культуру эксплантам.
9. В
табл
4.2
. после учета характеристик (заражение, нарастание ка
лусной ткани или появление органогенеза (процесс дифференциации в ка
лусных клетках, сопровождающийся образованием органов: корней, побегов,
novo
), в процессе последующего их наблюдения внести изменения в о
с−
тальные две графы.
Таблица 4.2
Наблюдение параметров роста культур изолированных тканей растений
Вид экспланта, к
ультуры, генотип
Номер
пробирки
Вариант среды
Кол
во введенных эксплантов, шт.
Наличие заражения
Изменения
Результат
дн.
дн.
дн.
дн.
дн.
дн.
дата
вариант

МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.1. ТСБГОЕОИЕ ЭХХЕЛУИГОПТУИ СБИОЫЦ РИУБУЕМЭОЫЦ ТСЕЕ РСИ ЛФМЭУИГИСПГБОИИ ИИПМИСПГБООЫЦ УЛБОЕК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Обработка полученных результатов
Разноплановость и разнообразие растительного материала, вводимого в
культуру, наличие нескольких этапов культивирования и длительность н
а−
блюдений диктуют необходимость строго учета параметров
культивируемых
объектов. Поскольку каждый эксплант вводится в отдельную пробирку (с
суд), то эта проба (пробирка) должна быть маркирована после введения эк
планта в культуру, а его параметры зафиксированы в учетной записи. Затем
при проведении наблюдений и
при пассажах должны быть отражены все и
менения объектов, произошедшие в период культивирования. Длительность
наблюдений каждой пробы до следующей пересадки составляет не более
е−
тыре
х недель.
При проведении экспериментальных работ по введению тканей раст
е−
ний в культуру и следующих этапов необходимо для каждого задания офо
мить
табл
4.2
и заполнить эту таблицу после окончания манипуляций в л
а−
минар
боксе (первые 4 графы) и после учета характеристик в процессе п
следующего их на
блюдения (остальные две графы). В графе
результат
а−
зыва
тся дата и вариант окончания данного этапа культивирования (сл
дующий пассаж или удаление в связи с заражением, высадка в грунт и т.
п.).
Количество строк соответствует введенным в культуру
эксплантам.
1.
Цто показывает анализ
полученны
результат
ов?
2.
Какие можно с
делать выводы по влиянию гормонального состава
среды на процессы регенерации в культуре зрелых зародышей
3.
акие условия лучше использовать для проведения дальнейшего
микроразмножения
Цель работы:
дать представление о возможностях второго способа
микроразмножения растений и роли фитогормонов в этом процессе.
Пол
чить растени
регенеранты путем прямого
органогенеза у бегонии и сенп
лии
комнатной фиалки.
Метод микроклонального размножения основан на способности изол
рованных частей растения восстанавливать недостающие органы при благ
приятных условиях питательной среды и таким образом регенерировать ц
е−
лые растения. Практически каждая клетка может стать источником целого
растения, и это можно наблюдать в культуре изолированных тканей.
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИ
Ю МИКРОКЛОНАЛЫНОГО Р
АЗМНОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.2. ИОЕФЛЦИа
ГПИОИЛОПГЕОИа БЕГЕОУИГОЫЦ РПЧЕЛ ОЕРПТСЕЕТУГЕООП ОБ УЛБОаЦ ЭЛТРМБОУБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых о
ганов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, ст
ебля, семяд
лей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот
процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один
цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1
или 100:1. В качестве ауксина
в этом случае наиболее часто используют
индолил
уксусную кислоту (ИУК) или
нафтилуксусную кислоту (НУК).
Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших
растений. Им были размножены многие луковичные цветочные растения
(нарциссы, лилии,
гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичной чешуи,
сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представит
е−
ли рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокк
ли)
из сегментов гипокотиля (участок стебля проростка с
еменного растения
ниже семядольного узла), котиледона (первый лист зародыша растения в с
е−
мени), листьев; лук, чеснок
из ткани донца луковиц; салат цикорный
из
сегментов листовых пластинок; петуния
из сегментов корней; глоксиния,
сенполия, стрепто
кар
пус, эшинапсус
из сегментов листовых пластинок, а
также некоторые представители древесных растений
из изолированных
зрелых и незрелых зародышей.
Материалы и оборудование:
истья бегонии и сенполии
ипохлорит натрия 5%
робирки со стерильной
питательной средой
с добавлением:
а) 6
БАП
0,4 мг/л и НУК
0,1 мг/л;
б) 6
БАП
2 мг/л и НУК
0,05 мг/л
+ витамины по прописи Нича (
табл. 4.1
БАП
0,4 мг/л +
НУК
0,1 мг/л;
терильные пинцеты,
скальпели, чашки Петри
таканы со стерильной водой.
Ход работы:
1. Срезают молодые, полностью развернувшиеся листья с черешками с
растения, выращенного в комнатных условиях.
2. Листья дезинфицируют с помощью раствора гипохлорита натрия
5,25
% в течение
10 мин.
3. Трижды ополаскивают стерильной водой и переносят в стерильные
чашки Петри.
4. Листья разрезают на фрагменты площадью 5 мм
и пинцетом пом
е−
щают их в пробирки проксимальной (расположенной ближе к центру тела
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИ
Ю МИКРОКЛОНАЛЫНОГО Р
АЗМНОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.2. ИОЕФЛЦИа
ГПИОИЛОПГЕОИа БЕГЕОУИГОЫЦ РПЧЕЛ ОЕРПТСЕЕТУГЕООП ОБ УЛБОаЦ ЭЛТРМБОУБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
или к его медианной плоскости) стор
оной вниз на поверхность агаризова
ной среды.
5. Листья бегонии высаживают на среду
, содержащую доба
ки витаминов по прописи Нича, и фитогормоны
БАП
0,4 мг/л и НУК
0,1 мг/л.
6. Листья сенполии на среду
с добавлением:
а) 6
БАП
0,4 мг/л
и НУК
0,1 мг/л;
б) 6
БАП
2 мг/л и НУК
0,05 мг/л
Культивирование осуществляют при 22
С, 16
часовом световом
дне и освещенности 1000 лк.
Придаточные побеги образуются без формирования каллуса прямо из
экспланта примерно через 4 недели. По оконч
ании 4
6 недель делят каждую
культуру, где образовались добавочные побеги, и ее фрагменты (отдельные
побеги) переносят на среду того же состава. Эту процедуру повторяют до п
лучения необходимого числа побегов.
Укореняют побеги, пересаживая их каждый по
отдельности на агариз
ванную среду
, содержащую НУК
0,1 мг/л. Укоренившиеся побеги пер
саживают в почву.
Обработка полученных результатов
1. Оформить
табл
4.2
(работа 4.1) и заполнить ее после окончания м
а−
нипуляций в лам
инар
боксе (первые 4 графы). Количество строк должно с
ответствовать введенным в культуру эксплантам. Каждая проба (пробирка)
должна быть зафиксирована после введения экспланта (отметить его размер)
в культуру.
2. По прошествии 1
24 недель в таблицу внося
т данные об измен
е−
ниях, произошедших в пробирках (заражение, изменение цвета и размеров
экспланта, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза), запо
няя остальные две графы.
1.
Каково
влияни
гормонального состава среды на процессы ин
дукции
возникновения адвентивных почек и развития из них побегов бегонии и се
полии
Проанализировать полученные результаты и сделать выводы
2.
акие условия лучше использовать для проведения микроразмнож
ния декоративных культур
3.
ачем нужны изменения
гормонального состава среды при пересадке
культур
4.
Каков
возможный коэффициент микроразмножения комнатных ра
с−
тений
Рассчитайте
ег
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн


4
4
.
.
3
3
.
.




























Цель работы:
знакомить с основным способом клонального микр
размножения растений и путями его использования. Провести выделение
апикальных
почечных
меристем
недифференцированная ткань, локализ
ванная в пределах верхушечной почки, представляющаяся обычно в виде
блестящей куполоподобной структуры
дистальной к само
му молодому ли
с−
товому примордию и размером, менее чем 0,1 мм в длину при вырезании)
картофеля и осуществить введение их в культуру (задание 1). Дать предста
ление о следующих этапах микроразмножения на примере микрочеренков
а−
ния пробирочных растений картофе
ля (задание 2) и дальнейшей их адапт
а−
ции к грунту (задание 3).
Активация развития уже существующих в растении меристем
это о
новной метод клонального микроразмножения растений. Главное направл
е−
ние его использования
получение генетически однородного, б
езвирусного
посадочного материала, путем введения в культуру меристемных тканей
апексов (верхушка побега и корня, состоящая из первичной меристемы,
обеспечивающей формирование всех частей и первичных тканей побега) и
пазушных почек органов стеблевого проис
хождения.
Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематич
ских тканях растений впервые высказано Цуигом в 1938 и Уайтом в 1943 гг.
Начиная с
х гг. были предприняты первые успешные опыты по получ
е−
нию свободных от вирусов растений георги
на из точки роста. Авторы этого
метода Морель и Мартин полагали, что в больном
растении вирус распр
страняется с отставанием от
быстрорастущих молодых органов, особенно в мол
дых недифференцированных тканях, где концентр
а−
ция вируса может снижаться вплоть д
о полного о
сутствия. Теоретические концепции, пол
женные в
основу этого метода, стали проясняться в последнее
время.
Строение точки рос
та растений имеет свою
специфику: дистальная ее часть, представленная ап
кальной меристемой, которая состоит из конуса н
а−
растания, а также одного или двух листовых зачатков
(примордий
первый, первичный
зачаточный лист
рис. 4.1
). У разных растений средний диаметр
до 200 мкм, высота от 20 до 150 мкм. В более низких
слоях дифференцирующиеся клетки меристемы обр
зуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей
системы.
Известно, что успех клонального
микрора
Рис. 4.1. Схема
мест формирования
рас
тительных мер
стем на побеге:
верхушечные,
ковые,
промеж
точные
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.3. ПИЕПСПГМЕОИЕ РПТБЕПЧОПДП НБУЕСИБМБ Г ЛФМЭУФСЕ БРИЛБМЭОЫЦ НЕСИТУЕН
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
множения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше
листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, з
а−
канчивающийся получением целого нормального пробирочного растения. С
другой стороны, чем больше размер выд
еляемого экспланта, тем больше в
е−
роятность присутствия в нем вируса. Вместе с тем зона, свободная от вир
сов, различна для вирусов и зависит также от вида и сорта растения. В кол
е−
оптиле (влагалищный, первый лист злаков, в отличие от настоящих, не имеет
лис
товой пластинки и представляет собой замкнутую трубку, в которую з
а−
ключены листовые зачатки и конус нарастания) злаков, например, размеры
участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм.
Наиболее часто в нашей стране метод оздоровления
посадочного
материала в культуре изолированных тканей растений используется для ка
тофеля.
Установлена неодинаковая эффективность при оздоровлении разли
ных сортов картофеля от вирусов и даже штаммов одного вируса. Мерист
е−
мы большего размера свободны от ви
руса скручивания листьев картофеля,
вирусов, наименьшего
от
вирусов. Оздоровить картофель от
последних наиболее трудно.
В числе многочисленных болезней картофеля особое место занимают
вирусные, вироидные и микоплазменные. Большинство из ни
х способно п
е−
редаваться через клубни, которые в случае заражения становятся резерват
рами инфекции. Кроме того, эти болезни обладают способностью быстро
распространяться. В результате сорт постепенно теряет свою первоначал
ную продуктивность и вырождается.
Продление жизни и длительное сохранение репродуктивных качеств
сорта достигаются за счет хорошо налаженного семеноводства или подде
живающей селекции, суть которой сводится к сохранению репродуктивных
качеств сорта в системе элитного семеноводства, а такж
е ежегодном прои
водстве элиты в необходимом объеме. Качество этой элиты обеспечивается
проведением семеноводства на безвирусной основе с применением биоте
нологических методов. Их регулярное применение обеспечивает повышение
урожайности картофеля в 2 раза
Культура изолированных апикальных меристем используется для п
лучения свободного от вирусов посадочного материала и для его микрокл
нального размножения. Апикальная меристема обычно совершенно свободна
от вирусов
представляет собой конус активно делящихся клеток высотой
0,1 мм (100 мк) и шириной 0,25
мм. Это минимальный размер меристемы,
при котором морфогенетическая способность еще
сохраняется. Поскольку
меристему бывает трудно вычленить без повреждений, часто ее отделяют
с
двумя
листовыми примордиями (апексы размером 100
250 мкм,
рис. 4.1
).
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.3. ПИЕПСПГМЕОИЕ РПТБЕПЧОПДП НБУЕСИБМБ Г ЛФМЭУФСЕ БРИЛБМЭОЫЦ НЕСИТУЕН
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Для повышения эффективности
оздоровления картофеля применяют сочет
а−
ние метода верхушечной меристемы с термо
или химиотерапией. Тепловая
обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибир
ют их развитие. Выращенные из апикальных меристем безвирусные растения
могут бы
ть размножены и высажены в теплицы для получения безвирусных
клубней. Для ускоренного размножения оздоровленного материала
используются также клубни, образовавшиеся на безвирусных растениях в
пробирках.
Материалы и оборудование:
лубни картофеля;
инокул
ярная лупа;
кальпели (или лезвия), зажатые в держателе с удлиненной ручкой;
репаровальные иглы;
енициллиновые флаконы со стерильной питательной средой
, с
держащей кинетин (0,5 мг/л) и активированный уголь и др.;
таканы со стерильной дистиллированно
й водой;
ашки Петри, скальпели, пинцеты.
Ход работы:
Подготовка ростков клубней для вычленения меристем заключается в
их проверке на исходную зараженность вирусами, поверхностном обеззар
а−
живании от грибных и бактериальных инфекций. Клубни картофеля хран
ят
при температуре 4
°С, затем проращивают на свету до образования ростков
3 см длины при 20
°С.
1. Клубень картофеля промыть в проточной воде, отделить ростки.
2. Ростки упаковать в марлевые салфетки, опустить в раствор 0,1
%
диацида на 3
5 мин.,
затем не менее трех раз промыть стерильной водой,
опустить в стерильную чашку Петри, добавив туда воды для предотвращения
высыхания эксплантов. Работы по вычленению проводят в ламинар
боксе.
3. Перед вычленением с помощью препаровальной иглы под бинок
ляр
ным микроскопом с верхушки ростка удалить покровные листочки, п
следовательно обнажая боковые и верхушечные меристемы с примордиал
ными листочками.
4. Меристему (
рис. 4.1
), включающую кусочек ткани
размером
100
250 мк без листовых зачатков (примордиев), вычленить иглой, зажатой в
цанговый держатель. Для этого можно использовать и специальную заточе
ную дисцизионную (разовую иглу от шприца) иглу или кусочек лезвия, заж
а−
тый в цанговый держатель. Эту о
перацию лучше проводить под бинокуля
ным микроскопом с 24
кратным увеличением с масштабной сеткой. Вычл
е−
нить можно как верхушечную, так и боковые меристемы
точки роста. Ка
дую операцию проводят отдельным простерилизованным инструментом.
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.3. ПИЕПСПГМЕОИЕ РПТБЕПЧОПДП НБУЕСИБМБ Г ЛФМЭУФСЕ БРИЛБМЭОЫЦ НЕСИТУЕН
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
5. После
вычленения меристему на острие иглы перенести на повер
ность питательной среды в пробирку или пенициллиновый флакон и закрыть
ее фольгой.
6. Чтативы с пробирками или поднос с флаконами поместить в свет
вую комнату.
7. Дальнейшее культивирование проводить
в световой комнате на сте
лажах.
Обработка полученных результатов:
1. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована после введ
е−
ния экспланта в культуру, а затем при проведении наблюдений и пассажах на
свежие питательные среды должны быть отражены все
изменения. Оформить
табл
4.2
и заполнить ее после окончания манипуляций в ламинар
боксе (пе
вые 4 графы). Количество строк соответствует введенным в культуру эк
с−
плантам.
2. В
табл
4.2
после учета
характеристик (заражение, нарастание ка
лусной ткани или появление органогенеза) в процессе последующего их н
а−
блюдения внести изменения в остальные две графы.
а б

Рис. 4.2. Этапы развития апикальной меристемы картофеля на питательной среде,
содержащей активированный уголь:
меристема после ведения в культуру;
начало
развития адвентивных почек;
формирование адвентивных побегов (фото Н.В.
Зобовой)
В течение периода регенерации (морфогенетический ответ на стимул,
который приводит к образованию органов, зародышей или целых растений)
разросшуюся ткань меристемы пересаживают на новую порцию той же ср
е−
ды для дальнейшего развития адвентивных поч
ек. Образовавшиеся пророс
ки пересаживают на новую по составу среду. Растения
регенеранты, соде
жащие до
пяти
междоузлий, используют для черенкования (задание 2).
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.3. ПИЕПСПГМЕОИЕ РПТБЕПЧОПДП НБУЕСИБМБ Г ЛФМЭУФСЕ БРИЛБМЭОЫЦ НЕСИТУЕН
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
1. Зачем в питательную среду при культивировании картофеля доба
ляется
активированный уголь?
2.
Какие выводы можно сделать
роанализирова
полученные резул
таты культивирования мери
стем
3. Какие условия лучше использовать для проведения дальнейшего
микроразмножения картофеля?
Клональное размножение оздоровленного картофеля решает вторую не
менее важную задачу
получение оздоровленного исходного материала в
количествах, достаточных для включения его в семеноводческую работу.
Одним из наиболее распространенных сп
особов ускоренного размножения
картофеля является черенкование в пробирочной культуре. Главное требов
а−
ние к питательной среде
обеспечение высокого коэффициента размнож
е−
ния, то есть максимального выхода растений из микрочеренков в минимал
ные сроки.
Этом
у требованию в наибольшей степени отвечает среда с минерал
ной основой по Мурасиге
Скуга с добавлением кинетина (0,04 мг/л), ИУК
(1,0 мг/л) и феруловой кислоты (0,02 мг/л). Суть метода сводится к следу
щему, растение извлекают пинцетом из пробирки и разр
езают на микроч
ренки, содержащие участок стебля 1
1,5
см с одним междоузлием
рис. 4.3
). Церенки высаживаются на питательную среду (
рис. 4.3
). Ра
множение основано на подавлении апикального доминирования (подавление
роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной по
ки) и активации путем удаления верхушечного побега пазушных меристем,
из которых при помещении на пи
тательную среду развивается побег
рис. 4.3
Растения
регенеранты, полученные в культуре тканей, должны быть
подвергнуты анализу на наличие вирусной инфекции. Контроль растений
регенерантов пров
одят с помощью нескольких методов.
Электронно
микроскопический анализ основан на визуальном выявл
е−
нии вирусов. Для приготовления препаратов при первом и последующих ч
е−
ренкованиях из нижней части растения отбирают один черенок с хорошо ра
витым листом
бы получить достоверные результаты, необходимо при
последовательных черенкованиях провести трехкратную диагностику
по 2
4 препарата каждый раз.
Биологический метод основан на определении инфекционных свойств
вирусов с помощью растений
индикаторов, реагирую
щих определенными
симптомами на тот или иной вирус.
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.3. ПИЕПСПГМЕОИЕ РПТБЕПЧОПДП НБУЕСИБМБ Г ЛФМЭУФСЕ БРИЛБМЭОЫЦ НЕСИТУЕН
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн

б в
Рис. 4.3. Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием:
микропобег
объект черенкования (линиями отмечены места разрезов при черенковании);
микрочеренок на питательной среде;
развитие растения картофеля из черенка (фото
Н.В. Зобовой)
Хорошие результаты дает использование для контроля зараженности
астений наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА),
основанного на использовании антител, меченых ферментом. За рубежом
этот метод известен как ЭЛИЗА
тест. В качестве фермента обычно испол
зуют щелочную фосфатазу с субстратом
нитрофенилф
осфатом, а также
пероксидазу хрена с 5
аминосалициловой кислотой или ортофенилдиамином
в качестве субстратов.
Материалы и оборудование:
робирочные растения картофеля (сформированные в результате в
полнения задания 1);
робирки с модифицированной питате
льной стерильной средой
с добавлением кинетина
0,04 мг/л, ИУК
1,0 мг/л;
терильные скальпели и чашки Петри.
Ход работы:
1. Выросшие в пробирках растения картофеля с 5
6 листочками пер
е−
нести из световой комнаты в бокс.
2. Пробирочное растение
картофеля вынуть пинцетом из пробирки и
поместить его в чашку Петри, разрезать на части (отрезок стебля с листом и
пазушной почкой), часть стебля над листом при этом должна быть в 2
3 раза
МОДУЛЫ 4. КУЛЫТУРА Р
АСТИТЕЛЫНЫХ КЛЕТОК И
ТКАНЕИ. ТЕХНОЛОГИЮ М
ИКРОКЛОНАЛЫНОГО РАЗМ
НОЕЕНИЮ
Сбвпуб 4.3. ПИЕПСПГМЕОИЕ РПТБЕПЧОПДП НБУЕСИБМБ Г ЛФМЭУФСЕ БРИЛБМЭОЫЦ НЕСИТУЕН
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
меньше, чем часть ниже листа. Необходимо соблюдать строгую стерил
ость.
3. Церенки перенести на свежую питательную среду в пробирки, загл
бив нижнюю часть стебля в среду.
4. Закрыть пробирки фольгой, поставить в штатив и перенести в свет
вую комнату.
Церенкование проводят с интервалом 14
21 день.
1. Сколько
черенков можно получить из клубней одного растения ка
тофеля за
три
месяца?
2. С помощью каких процедур увеличивается эффективность оздоро
ления растений в культуре апикальных меристем?
3. Какие способы микроразмножения растений используются при п
лучении
безвирусного посадочного материала картофеля?
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Работы не предусмотрены.
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель
знакомство с основными подходами получения целевых проду
тов биотехнологии, их анализа современными методами жидко
жидкостной
хроматрграфии и хромато
масс
спектрометрии.
Задачи
общая характеристика выделения и
очистки
целевых продуктов би
технологии и освоение метода экстракции на примере биоразрушаемых п
лимеров;
освоение метода гель
проникающей жидко
жидкостной хроматогр
а−
фии на основе высокоэффективной хроматографической системы
Breeze
фирмы
Ωατeρσ (СЧА)
освоение метода хромато
масс
спектрометрии на примере анализа
жирных кислот бактерий с использованием
хромато
масс
спектрометра
Agileντ 5975Iνeρτ (Agileντ, СЧА).
Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших пр
мышленное применение, приводи
т к необходимости рассмотреть общие,
наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнол
гического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют
на
два
большие группы: производство биомассы и получение продуктов м
е−
таболизма.
Стадия получения конечного целевого продукта в биотехнологии с
щественно различается в зависимости от природы продукта и его локализ
а−
ции. Если продукт находится в
культуральной жидкости,
то он, как правило,
образует
очень разбавленны
раствор
и суспензи
, содержащи
, помимо
целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разд
е−
лять смеси веществ очень близкой природы,
поэтому необходимо использ
вать методы, позволяющие провести разделение, например, тот или иной вид
хроматографии. Если цел
евой продукт локализуется в клетке, то
нужно
с−
пользовать более сложный подход к его извлечению из клетки.
Заключительная стадия биотехнологического производства
приг
товление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства проду
тов микробиологичес
кого синтеза является их недостаточная стойкость к
хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представл
ют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет
технологов принимать специальные меры для повышения сохранности
е−
паратов промышленной биотехнологии.
Независимо от локализации
целевого
продукта
на первом этапе
его
очистки
проводят отделение массы продуцента от жидкой фазы
сепарацию.
Иногда сепарации предшествует специальная обработка
изменение рН, н
а−
гревание,
добавление коагулянтов белков или флокуллянтов для более э
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВ
АНИЮ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
фективного отделения биомассы и стабилизации продукта. Существует н
е−
сколько способов сепарации.
Для выделения и очистки продуктов,
аходящихся внутри клеток пр
дуцента (например
интерферонов, го
рмонов)
вводится стадия разрушения
клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого примен
я−
ются механические, химические или комбинированные методы.
К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразв
ком, вращение лопасти или ви
братора, встряхивание со стеклянными бусами,
продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замор
женной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замор
а−
живание
оттаивание, декомпре
сия (сжатие с последующим резким сниж
нием
давления).
Физические способы разрушения клеток более экономи
ные, чем химические и химико
ферментативные. В то же время этим спос
бам дезинтеграции клеток присуща неизбирательность: обработка может
влиять на качество получаемого продукта.
Химические и х
имико
ферментативные методы более избирательны.
Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками,
ферментами.
Клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом
в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты или других детергентов,
клетки дрожжей
зимолиазой улитки или ферментами грибов, актиномиц
е−
тов. Можно использовать автолиз клеток при лимитировании по определе
ному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагом.
За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточ
ных стенок.
Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. О
нако применяют более высокоскоростное центрифугировани
или фильтры
с меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехн
логических процессах клеточные стенки
отбрасывают как балласт, но во
можно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как цел
е−
вого продукта.
Для идентификации структуры и степени чистоты биотехнологическ
го продукта применяют различные методы, среди которых наиболее знач
мыми сегодн
я являются хроматография и масс
спектрометрия.
роматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего
столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее
определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в
целом. Х
отя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты
его открытия
оказались
столь значимы для всех естественных наук, что Ф
е−
дерация
европейских химических обществ
приводит имя Цвета наряду с ч
е−
тырьмя другими русскими именами
Ломоносов, Менделе
ев, Бутлеров и С
менов
в числе ста выдающихся химиков прошлого.
настоящее время
хроматография представляет собой:
самый распространенный и совершенный метод разделения смесей ат
мов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и
оптические
изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов,
устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц;
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВ
АНИЮ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
уникальный метод качественного и количественного анализа с
ложных
многокомпонентных смесей;
сам
остоятельн
ое научное направление и важный физико
химический
метод исследования и измерения;
препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом
виде;
мощную отрасль научного приборостроения.
Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматогр
а−
фией по универсальности применения и эффективности разделения самых
сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографич
е−
ских капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены б
лее 1000 индивидуальных компонентов, например, в бе
нзиновых фракциях
нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биол
гических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря
сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электр
фореза стала возможной расшиф
ровка нуклеотидной последовательности
ДНК и завершение работ по программе "Геном человека".
Диапазон применения хроматографических методов огромен: от анал
за атмосферы планет Солнечной системы до полного анализа содержимого
одной живой клетки. Исключител
ьную роль хроматография играет в химич
е−
ской, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно
бумажной и многих
других отраслях промышленности, прежде всего в технологическом контр
ле и поддержании оптимального режима производства, в контроле исходного
сырья
и качества готовой продукции, анализе газовых и водных сбросов пр
изводства.
В биотехнологии хроматография является основным процессом выд
е−
ления вирусов гриппа, энцефалита, бешенства и ящура, очистки вакцин, пр
мышленного производства инсулина, других
белков и полипептидов. На
промышленную основу поставлено хроматографическое выделение фуллер
е−
нов, сапонинов, интерлейкина
2 человека, гистонов, плазмид, ДНК, антиби
тиков и многих других ценнейших природных и синтезируемых веществ.
Масс
спектрометрия
это
физико
химический метод измерения отн
шения массы ионов к их заряду. Приборы, которые используются в этом м
тоде, называются масс
спектрометрами или масс
спектрометрическими д
е−
текторами, которые имеют дело с материальным веществом, состоящим, как
известно
, из мельчайших частиц
молекул и атомов. Масс
спектрометры у
с−
танавливают молекулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный с
став, а также пространственную структуру расположения атомов.
Как аналитический метод масс
спектрометрия обладает исключи
тел
ьно
высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества
органического вещества в больших объ
емах газов и жидкостей, а также в
биологических системах. С по
мощью масс
спектрометрии можно изучать
превращения ве
щества в процессе химическо
й реакции, что
важно
для уст
а−
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВ
АНИЮ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
новления ее механизмов.
Существенное отличие масс
спектрометрии от др
гих аналитических физико
химических методов состоит в том, что оптич
е−
ские, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или
поглощение энерг
ии молекулами или атомами (например, такие методы как
, УФ
, КР
и ЮМР)
, а масс
спектрометрия имеет дело с самими частицами
вещества и
в отличие от вышеуказанных методов,
является деструктивным
методом анализа, то есть из образующихся при разрушении мо
лекулы ионов
исходная молекула регенерироваться не может.
етод масс
спектрометрии
основан на ионизации молекул, разделении ионов в газовой фазе, которое
происходит в зависимости от соотношения их массы и заряда, и регистрации
разделенных ионов
В данном
разделе лабораторных работ будут использованы новейшие
приборы Центра коллективного пользования СФУ, а также оборудование,
расположенное на кафедрах и лабораториях Института фундаментальной
биологии и биотехнологии.
Завершающая стадия биотехнологического процесса
выделение цел
е−
вого продукта.
Эта стадия существенно различается в зависимости от лок
а−
лизации продукта и его химической природы. Если продукт находится в
культуральной жидкости, то он, как правило, образует очень разбавленные
растворы и суспензии, содержащие, помимо целевого, большое
количество
других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень бли
кой природы, поэтому необходимо использовать методы, позволяющие пр
вести разделение, например, тот или иной вид хроматографии. Если целевой
продукт локализуется в клетке, то
необходимо использовать более сложный
подход к его извлечению из клетки.
Независимо от локализации целевого продукта,
на первом этапе его
очистки проводят отделение массы продуцента от жидкой фазы
сепарацию.
Существует несколько способов сепарации
лотация
разделение мелких частиц и выделение капель диспер
ной фазы из
эмульсий
. Этот метод основан на различной смачиваемости ча
с−
тиц
жидк
остью
и на их избирательно
прилипании к поверхности раздела.
Основные виды флотации
пенная, масляная и пленочная. Наибольшее ра
с−
пространение в биотехнологии получила пенная флотация, которая заключ
а−
ется в следующем: культуральную жидкость с биомассой ми
кроорганизмов
непрерывно вспенивают воздухом, подаваемым снизу вверх под давлением.
Клетки и их агломераты прилипают к пузырькам тонкодиспергированного
воздуха и всплывают вместе с ними, собираясь в специальном отстойнике.
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Этот метод идеален для
дрожжей,
которые имеют относительно большие
клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы фл
тацией их отделяют на обычных барабанных вакуум
фильтрах.
Фильтрация
В этом методе используется принцип задержки биома
с−
сы
на пористой фильтрующей
перегородке. В настоящее время используются
разные фильтры: барабанные, дисковые, ленточные, тарелочные, карусел
ные вакуум
фильтры, фильтры
прессы различной конструкции, мембранные
фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток, однако при этом
эффек
тивность фильтрации практически не снижается, т
ак
ак
по мере пр
хождения жидкости диаметр капиллярных каналов сужается из
за прилип
а−
ния частиц к стенкам. По мере утолщения слоя биомассы на фильтре ск
рость протока жидкости падает. Для фильтров непрерывног
о действия, ра
считанных на длительное действие, предусматривают системы автоматич
е−
ского удаления слоя биомассы, забивающего поры. Биомассу сдувают с п
верхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. Т
а−
кой способ удаления биомассы характер
ен для барабанного вакуум
фильтра.
Существуют также фильтры, предназначенные для однократного или
многократного периодического использования. Среди них выделяют ме
м−
бранные фильтры, через которые возможно проводить фильтрацию очень
разбавленных растворов. О
днако проблемой использования таких фильтров
является их закупорка клетками, белками, коллоидными частицами. Приемы
сдувания или срезания для этих фильтров не приемлемы, т
ак
ак
они быстро
разрушаются. Оди
из путей преодоления этих проблем
покрытие мемб
ран
гидрофильным слоем. В настоящее время создана целая отрасль по прои
водству мембранных фильтров и существуют огромное количество фирм, к
торые поставляют фильтры для всех задач биотехнологии.
Центрифугирование
Осаждение взвешенных частиц происходи
т под
действием центробежной силы. После разделения образуется
две
фракции:
биомасса (твердая) и культуральная жидкость. Центрифугирование требует
более дорогостоящего оборудования, чем вышеперечисленные методы сеп
а−
рации. Поэтому оно оправдывает себя, если
, во
первых, суспензия фильтр
ется медленно, во
вторых, необходимо максимально освободить культурал
ную жидкость от частиц, в
третьих, н
ужно
наладить непрерывный процесс
сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодический
режим. Центрифу
гирование и фильтрация могут проходить одновременно,
этот процесс реализован в фильтрационных центрифугах. Наиболее перспе
тивны для осаждения центрифуги
сепараторы, в которых биомасса осаждае
ся на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной т
арельч
а−
той вставки.
Следующим этапом получение целевого продукта является разрушение
клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химич
е−
ским и химико
ферментативным методами.
К физическим методам дезинт
грации относятся обработка ультразв
уком, вращение лопасти или вибратора,
встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание
в ступке, осмотический шок, замораживание
оттаивание, декомпре
сия (сж
а−
тие с
последующим резким снижением давления). Физические способы ра
рушения клеток более экономичные, чем химические и химико
ферментативные. В то же время этим способам дезинтеграции клеток прис
ща неизбирательность: обработка может влиять на качество получаем
ого
продукта. Химические и химико
ферментативные методы более избирател
ны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками,
ферментами.
За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок.
Для этого используют те же методы
фильтрации и центрифугирования. О
нако применяют более высокоскоростное центрифугировани
или фильтры с
меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехн
логических процесс
клеточные стенки отбрасывают как балласт, но во
можно и промышл
енное получение компонентов клеточных стенок как цел
е−
вого продукта.
Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомог
е−
ната разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или а
сорбции. В данной работе для выделения целевого проду
кта будет использ
ван метод экстракции органическим растворителем.
Экстракция
это процесс избирательного извлечения одного или н
е−
скольких растворимых компонентов из твердых тел или растворов с пом
щью жидкого растворителя
экстрагента. Различают твердо
жидкостную и
жидко
жидкостную типы экстракции.
При твердо
жидкофазной экстракции
вещество из твердой фазы переходит в жидкую; при жидко
жидкофазной
из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки
переходит в бензин). Еидко
жидкостную
экстракцию органическими раств
рителями часто применяют для извлечения из культуральной среды антиби
тиков, витаминов, каротиноидов, липидов. Витамин В
экстрагируют фен
лом, высокоспецифичным экстрагентом является бензиловый спирт. Такие
фосфолипиды
к фосфатидилэтанол и фосфатидилхолин
извлекаются хл
роформом.
Эффективность экстракции может быть повышена за счет повторной
экстракцией свежим экстрагентом, выбором оптимального растворителя, н
а−
греванием экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкост
и, пониж
нием давления в аппарате для экстракции. Во многих случаях процесс нагр
е−
вания может быть губительным для целевого продукта. Для предотвращения
этого используется криоэкстракция, которая осуществляется растворителями,
кипящими при низких температур
ах и находящимися при комнатной темп
е−
ратуре в газообразном состоянии. Для экстракции неполярных соединений
используют жидкий пропан или бутан. При последующем осторожном н
а−
гревании до 0
°С растворитель улетучивается и остается продукт в чистом
виде.
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Экстракция хлороформом используется при выделении из бактериал
ной биомассы полигидроксиалканоатов (ПГА)
, представляющи
собой пол
эфиры 3
гидроксиалкановых кислот с разной длиной цепи.
Основные структуры
ПГА
представлены
следующим образом:

1 R = водород
поли (3
гидроксипропионат),
R = метил
поли (3
гидроксибутират),
R = этил
поли (3
гидроксивалерат),
= пропил
поли (3
гидроксигексаноат),
= пентил
поли (3
гидроксиоктаноат),
= нонил
поли
гидроксидодеканоат),
= водород
поли (4
гидроксибутират),

= водород
поли (5
гидроксивалерат).
Полимер хорошо растворяется в хлорсодержащих органических ра
с−
творителях, таких как хлороформ, трихлорметан, трихлорэт
ан, но не раств
ряется в спиртах, ацетоне, гексане, воде. Эти свойства полимера использую
ся при его отделении от липидов после извлечения из бактериальных клеток.
Существует несколько подходов для извлечения ПГА из клеток. С
рую биомассу, собранную центри
фугированием, заливают 20 объемами хл
роформа и оставляют на 15
20 часов в ямкости при комнатной температуре
при периодическом перемешивании. Далее разделяют биомассу и хлороформ
с полимером в делительной воронке, нижний слой хлороформа собирают, а
остаток
биомассы еще трижды экстрагируют хлороформом для усиления
полноты экстракции.
Объединенные хлороформные экстракты полимера и
липидов концентрируют, добавляют двойной объем спирта или гексана. В
павший в осадок полимер отделяют от смеси растворителей.
Вто
рой подход,
используемый в лабораторных условиях, заключается в следующем: предв
а−
рительно лиофилизированная биомасса закладывается в патрон аппарата С
кслет
и полимер экстрагируется хлороформом в течение нескольких часов.
Третий подход выделения полимера
заключается в удалении из биомассы
неполимерных компонентов и получени
гранул полимера. Для этого обычно
обрабатывают биомассу детергентами, такими как додецилсульфат натрия,
ЭДТА или лизирующими ферментами. Такое извлечение особенно эффе
тивно для выделе
ния полимера из клеток с высоким его содержанием. Одн
а−
ко чаще всего гранулы полимера, выделенные после химической или фе
ментативной обработки биомассы, загрязнены остатками бактериальных кл
е−
ток и требуется дополнительная экстракция полимера и его осаждени
е.
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Наиболее перспективными для биотехнологического производства
биоразрушаемых полимеров ПГА являются водородокисляющие бактерии,
группа
грамотрицательных
аэробных бактерий, способных накапливать п
лимер более 90 % на сухое вещество.
Водородные бактерии
широко распространены в природе. Они хара
теризуются способностью к росту
как
на минеральном субстрате за счет
энергодающей реакции окисления водорода и использования углекислоты в
качест
ве конструктивного субстрата, так и на различных органических с
едине
ниях.
Специфика хемолитотрофии на водороде заключается в фун
ционировании в клетках водородактивирующей системы. Активацию вод
рода и передачу электронов в ЦПЭ производит гидрогеназный ферментный
комплекс по реакции: Н
→ 2Н
. Продукты катаболизма
ТФ и во
с−
становительные эквиваленты в виде НАДН потребляются главным образом
при ассимиляции углекислоты в восстановительном пентозофосфатном ци
ле и на путях синтеза аминокислот. Среди ранних продуктов фиксации угл
е−
кислоты
фосфоглицериновая кислота и пер
вично синтезируемые амин
кислоты (глутаминовая, аспарагиновая, аланин), служащие субстратом для
синтеза всех остальных аминокислот. В качестве запасных соединений ба
терии накапливают полимеры гидроксипроизводных жирных кислот и пол
фосфаты. Рост и направл
енность биохимической программы синтеза клето
ных макромолекул у водородных бактерий определяются условиями вне
ней среды, а также концентрацией биогенных элементов, рН и температуры
среды.
Цель работы
знакомство с основными методами получения целевого
родукта биотехнологии
биоразрушаемого полигидроксиалканоата.
Материалы и оборудование:
успензия бактерий
Ralstonia
eutroph
5786, выращенных в условиях
лимита по азоту
ысокоскоростная центрифуга
Avanti
XPI
Beckman
Int
., СЧА)
налитические
весы
испергатор
IKA
(Германия)
елительная воронка объемом 1
2 л
оторный испаритель
Rotovapor
210/
Buchi
, Германия)
одяная баня
братный холодильник
лороформ
пирт этиловый
ексан
ерная кислота
езводный сернокислый натрий
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
оронки
олбы
со шлифом
юксы
одоструйный насос
ысокоскоростная центрифуга
Avanti
XPI
Beckman
Int
.,
СЧА)
оторный испаритель
Rotovapor
210/
Buchi
Чвейцария)
Характеристика оборудования
Для осаждения биомассы бактерий используется высокоскоростная
центрифуга
рис. 6.1
, позволяющая центрифугировать большие объемы
(до 6 л) бактериальной суспензии при 6000 об/мин в условиях пониженной
температуры
Рис. 6.1.
Высокоскоростная напольная центрифуга
с охлаждением
Avanti
XPI
Beckman
Coulter
Int
., СЧА
Технические характеристики центрифуги
Размеры: 865х876х711 мм
Максимальная скорость вращения 26 000 об/мин
Максимальное ускорение 82
000
Максимальная вместимость ротора
6 л
Контроль скорости: ±10 об/мин
Объем центрифужных пробирок от 1,5 до 1000
Система охлаждения камеры: экологически безопасный хладо
гент
Устанавливаемый температурный режим камеры:
от
С до 40
Контроль температуры камеры ±2
Контроль дисбаланса ±2
% при загрузке в противоположные позиции
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Тип двигателя: вентильно
индукторный
Программы, устанавливаемые пользователем: 30 программ (двухэта
ные)
Установка времени: до 180
мин
Динамическое определение ротора: автоматическое
Набор роторов
Ротор на 8 стаканов
8 x 50 мл, 26000 об/мин, 81770 g.
Ротор на 6 пробирок: 6х1000мл, 8000 об/мин, 15910
Для отгонки растворителей после экстракции полимера используется
роторный испаритель
Rotovapor
210/
Buchi
, Чвейцария)
высокой прои
водительности
рис. 6.2
Рис. 6.2.
Роторный испаритель
Rotovapor
Buchi
, Чвейцария)
Технические характеристики
Роторный испаритель позволяет п
роводить операци
по упариванию
растворов термолабильных веществ в органических и водных растворителях
в условиях, предотвращающих их разложение, в том числе в вакууме с во
можностью автоматической регулировки уровня вакуума, подачи инертных
газов в систему, улавливания ра
створителей и работы без использования л
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
вушек жидкого азота
также проведение сопутствующих операций
включая
сушку твердых веществ, перекристаллизации и т.
Возможность использования отгонных колб объемами от 50 мл
до 4 л с
массой
колбы с растворител
ем до 3 кг ( в случае опытных нараб
ток)
Возможность запитки отгонной колбы без остановки операции о
гонки (в случае опытных наработок)
Наличие электромеханического подъемника отгонной колбы
Скорость вращения отгонной колбы
регулируемая в пределах
от 0
до 280 об
мин
Нагревательная баня с цифровым дисплеем индикации заданной и
реальной температуры с регуляцией температуры в пределах от комнатной
до 180
Вакуумное уплотнение
устойчивое к органическим растворителям и
агрессивным средам
Наличие
инертного к агрессивным средам и растворителям безма
с−
ляного вакуумного насоса, обеспечивающего производительность
до 30 л
мин и вакуум до 7 мм
рт.
ст
, обеспечивающего легкую очистку кл
а−
панов, оснащенного ловушкой между роторным испарителем и насосом и л
ушкой для остаточных количеств растворителей
устанавливаемой за нас
сом
Наличие вакуумного контроллера, обеспечивающего задание ваку
ма в мм
рт.
ст
или миллибарах, автоматическое поддерживание заданного
вакуума в вакуумируемой системе, индикацию заданно
го и реального
вакуума.
Оборудование рассчитано на напряжение в сети 220
, частоту
Ход работы:
1.
Суспензию бактериальных клеток поместить в центрифужные стак
а−
ны и уравновесить на весах. Далее уравновешенные стаканы поместить в р
тор центрифуги
anti
XPI
. Центрифугирование проводить в течение
20 мин при 7000 об/мин.
2.
После остановки центрифуги вынуть стаканы, слить супернатант, из
твердого остатка биомассы, осевшей на дно стакана, взять навеску 1 г на ан
а−
литических весах и перенести в стакан
дезинтегратора.
3.
Для определения содержания сухого вещества в биомассе в предв
а−
рительно взвешенный бюкс (А г) поместить 200
250 мг сырой биомассы,
взвесить бюкс с сырой навеской (Б г), поставить в сушильный шкаф и сушить
в течение 24 ч при температуре 1
°С.
4.
После высушивания бюкс вынуть из шкафа и охладить в эксикаторе.
Охлажденный бюкс взвесить и записать навеску (В г). Затем снова поставить
бюкс с высушенной биомассой в сушильный шкаф и сушить пробу в течение
5 ч. Процедуру охлаждения бюкса повторить и снова взвесить. Если вес
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
бюкса не изменился, то проба высохла до абсолютно сухого веса и можно
рассчитать сухой вес биомассы по формуле
Сухой вес = (В
А)х100/(Б
А) (
5.
К сырой биомассе в стакане
дезинтегратора добавить 10 мл смеси
хлороформа и спирта (2:1 по объему) и обработать биомассу на дезинтегр
а−
торе
IKA
в течение 30 с для разрушения бактериальных клеток.
6.
Затем количественно перенести разрушенную биомассу в колбу с
притертой пробкой и доба
вить еще 10 мл смеси спирт
хлороформ, колбу з
а−
крыть и оставить на 3 ч для экстракции из биомассы полигидроксиалканоата
и липидов при периодическом помешивании.
7.
Отделить фильтрованием на стеклянном фильтре под вакуумом в
доструйного насоса растворитель и
остатки биомассы. Промыть 3 порциями
хлороформа по 5 мл осадок на фильтре для полноты извлечения полимера.
Хлороформ объединить с растворителем.
8.
Смесь растворителей пропустить через безводный сернокислый н
а−
трий. Для этого используется обычная воронка с
ватой, на которую наноси
ся слой соли.
9.
Обезвоженный экстракт поместить во взвешенную коническую ко
бу (А г), отогнать растворитель на роторном испарителе
Rotovapor
210/
поместить колбу с экстрагированными липидами и полимером в эксикатор на
2 ч, а з
атем взвесить (Б г).
Для отделения полимера от липидов в колбу с экстрактом налить
5 мл хлороформа. После полного растворения экстракта добавить 2 объема
гексана (10 мл). В этих условиях происходит осаждение полимера в виде
хлопьев, а липиды остаются р
астворенными в хлороформе.
Отделить полимер от растворителя на стеклянном фильтре, пр
мыть
тре
мя (по 5 мл) порциями гексана полимер, осевший на фильтр, кол
чественно собрать с фильтра полимер во взвешенный бюкс (В г), сушить в
течение 2 ч в сушильном
шкафу при 60
°С.
12.
Перенести бюкс с полимером в эксикатор. После остывания взв
е−
сить бюкс с полимером и рассчитать содержание выделенного полимера из
биомассы.
13.
Для расчета содержания полимера в сухой биомассе будем учит
вать сухой вес сырой биомассы.
Если сухой вес составляет 50
%, то для эк
с−
тракции полимера было взято 500 мг сухой биомассы. Далее по разности
бюкса с полимером и пустого (Г
Б) находим количество выделенного пол
мера. Если за 100 % принять вес сухой биомассы, то содержание полимера
буде
т составлять (Г
Б)х100/500 (%). Таким образом определяется содержание
полимера весовым методом. Выделенный полимер сохраняется для следу
щих лабораторных работ
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
14.
Растворитель с липидами собрать в отдельную колбу, отогнать на
роторном испарителе, липидны
й экстракт сохранить для следующих лабор
а−
торных работ в морозильной камере холодильника.
Для проверки полноты экстракции необходимо определить соде
жание полимера в сухой биомассе хроматографическим методом. Для этого
взвешиваем на аналитических весах
4 мг сухой биомассы, переносим навеску
в колбу со шлифом, добавляем 1 мл метанола, 0
75 мл концентрированной
серной кислоты и 1 мл хлороформа с внутренним стандартом. В качестве
внутреннего стандарта используется бензойная кислота (0,5 мг/мл). Прикр
е−
пляем
колбу к обратному холодильнику, помещаем в водяную баню и пров
дим метанолиз в течени
5 ч при температуре 90
°С. После того как колба с
реакционной смесью остынет, ее снимаем и добавляем 2 мл дистиллирова
ной воды. После расслоения фаз (нижняя хлороформ
ная фаза содержит м
е−
тиловые эфиры мономеров полимера и бензойной кислоты) записываем пр
бу на газовом хроматографе и рассчитываем содержание полимера в исхо
ной биомассе
(образ
ец хроматограммы дан на
рис. 6.3
Расчет проводится так
стандарт
соответствует 0
5 мг, а
Х мг. Из
пропорции находим
Х =
5/
стандарт
где
коэффициент, полученный экспериментальным путем. Процентное
содержание полимера находим из учета навески.
16. Оценить
полноту экстракции, сравнивая результаты весового и
хроматографического методов определения полимера в биомассе.
Оформляем результаты в виде
табл
6.1
Рис
ипичная
хроматограмма полигидр
ксибутирата после метан
лиза. Пик, обозначенный
как С
, соответствует м
номеру гидроксибутирата
внутренний с
тан
дарт
зойная кислота (материал
кафедры биотехнологии
ИФБиБ СФУ)
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.1. ГЫЕЕМЕОИЕ ЦЕМЕГПДП РСПЕФЛУБ ОБ РСИНЕСЕ ВИПСБИСФШБЕНПДП ВИПРМБТУИЛБ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Таблица 6.1
Сравнение весового и хроматографического методов определения содержания
полиме
ров
в биомассе бактерий
Навеска
Содержание полимера
Полнота
экстракции
Весовой метод
Хроматографический
метод



1.
Каковы
основные методы сбора биомассы
ать краткую характер
стику этим методам.
2.
Каковы м
етоды разрушения
клеток
3.
колько
основны
этап
выделения целевого продукта
4. Цто такое экстракция?
5. Какой экстрагент подходит для выделения полигидроксиалканоатов
из бактерий?
6.
чем заключается п
ринцип весового метода определения содерж
а−
ния полимера в бактерия?
7. В чем преимущество хроматографического метода определения с
держан
ия полимера?


6
6
.
.
2
2
.
.
























-
-


зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего ра
с−
пределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают
следующие основные виды хроматографии:
адсорбционную,
распределительную,
ионообменную,
эксклюзионную (молекулярно
сит
овую)
осадочную.
Адсорбционная хроматография
основана на различии сорбируемости
разделяемых веществ адсорбентом (твярдое
тело с развитой поверхностью).
Распределительная хроматография
на разной растворимости ко
м−
понентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесянная
на твярдый макропористый носитель) и элюенте (следует иметь в виду, что
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.2. ИИФЧЕОИЕ СБТРСЕЕЕМЕОИа НПМЕЛФМаСОЫЦ НБТТ ВИПРМБТУИЛПГ НЕУПЕПН ДЕМЭ
ХИМЭУС
БЦИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
при распределительном механизме разделения на перемещение зон комп
нентов частичное влияние оказывает и адсорбцион
ное взаимодействие ан
а−
лизируемых компонентов с твярдым сорбентом).
Осадочная хроматография
основана на различной способности ра
деляемых компонентов выпадать в осадок на твярдой неподвижной фазе.
Ионообменная хроматография
на различии констант ион
енного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами
разделяемой смеси.
Эксклюзионная (молекулярно
ситовая) хроматография
на разной
проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый
неионогенный гель). Эксклюзионная хром
атография подразделяется на гель
проникающую (ГПХ), в которой элюент
неводный растворитель, и гель
фильтрацию, где элюент
вода.
Последний тип хроматографии является разновидностью жидкостной
хроматографии и в аппаратурном оформлении ничем не отличаетс
я от других
видов жидкостной колоночной хроматографии
в том числе от высокоэффе
тивной жидкостной хроматографии (ВЭЕК).
ВЭЕХ
это жидкостная колоночная хроматография
механизмы
сор
ции в которой могут использоваться самые различные
По существу
ВЭЕХ
это современная форма реализации классической жидкостной колоночной
хроматографии
Ниже перечислены некоторые наиболее существенные кач
е−
ственные характеристики ВЭЕК
высокая скорость процесса
позволившая сократить продолжител
ность разделения от
нескольких часов и суток до минут
минимальная степень размывания хроматографических зон
что дает
возможность разделять соединения
лишь незначительно различающиеся по
константам сорбции
высокая степень механизации и автоматизации разделения и обр
а−
ботки информации
благодаря чему колоночная жидкостная хроматография
достигла нового уровня воспроизводимости и точности.
Гель
фильтрация
обычно используется и для разделения молекул, и
для определения их размеров. Колонки, предназначенные для гель
фильтр
ации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при
использовании таких колонок происходит разделение белков или других с
единений по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения
через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные
молекулы ост
а−
ются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят
через колонку и выходят из нее первыми (
рис. 6.5
). В качестве матрикса
можно использовать зерна поперечно
сшитого п
олисахарида (декстран или
агароза). Таким образом, при помощи ГПХ можно разделить смеси веществ в
зависимости от размеров их молекул. Выход веществ из колонки происходит
в порядке уменьшения их молекулярной массы. Так можно разделить пол
пептиды, белки и д
ругие макромолекулы. Гельпроникающая хроматография
на колонке используется для очистки пестицидов, а также жирорастворимых
витаминов перед их определением методом ВЕХ.
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.2. ИИФЧЕОИЕ СБТРСЕЕЕМЕОИа НПМЕЛФМаСОЫЦ НБТТ ВИПРМБТУИЛПГ НЕУПЕПН ДЕМЭ
ХИМЭУС
БЦИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Рис. 6.
Принципиальная типичная с
хема жидкостного хроматографа
резерв
ар; 2
дегазатор; 3
смеситель; 4
фильтр; 5
насос; 6
перекрывающие краны; 7
ройство для сглаживания пульсации давления; 8
предварительная насыщающая колонка;
устройство для ввода проб; 10
хроматографические колонки; 11
детектор; 12
мос
тат; 13
измеритель потока; 14
кран; 15
сборник фракций; 16
гистратор
Рис. 6.
. Хроматография на основе молекулярных сит (
омпоненты, размеры к
торых соответствуют размерам пор или входов в поры адсорбента, задерживаются на к
лонке):
а, б
две стадии процесса
Основной тип сорбенты для гельпроникающей хроматографии
ст
ДВБ. Гельпроникающая хроматография широко используется для изуч
е−
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.2. ИИФЧЕОИЕ СБТРСЕЕЕМЕОИа НПМЕЛФМаСОЫЦ НБТТ ВИПРМБТУИЛПГ НЕУПЕПН ДЕМЭ
ХИМЭУС
БЦИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
ния распределения молекулярных масс полимеров. Этот процесс можно ре
а−
лизовать на специально собранной с
истеме высокоэффективной жидкостной
хроматографии
Breeze
фирмы
Ωατeρσ (СЧА) (
рис.
).
Прибор
комплектуе
ся
изократическим
насосом,
ручным
инжектором,
рефрактометрическим
е−
тектором и собственным
программным обеспечением,
адаптированн
для
пользователей, имеющих начальный опыт работы с ВЭЕХ.
Гельпроника
щая хроматография
наиболее простая технология для молекулярно
массового разделения полимеров. Олигомеры, мономеры и добавки в ко
м−
плексных полиме
рных растворах также могут быть разделены, если молек
лярно
массовые разницы между компонентами существенны. Для характер
стики полимеров разработаны специальные колонки: Sτyραgel
UlτραSτyραgel™ и Shodex
, которыми снабжена хроматографическая система
eze
Рис. 6.6.
Общи
вид ВЭЕК
Breeze
фирмы Ωατeρσ (СЧА)
Цель работы
приобретение навыков работы с жидко
жидкостной
хроматографией.
Материалы и оборудование
олигидроксибутират, выделенный из биомасса
. eutrophus
5786;
истема ВЭЕХ Бриз с ручным инжектором и рефрактометрическим
детектором для анализа молекулярно
массовых распределений полимеров
абор полистеролов с молекулярной массой от 50 000 до 600 000 даль
тон для построения калибровочного графика.
Ход работы:
1.
Приготовить 0
% раствор полимера в хлороформе. Для этого надо
взвесить 50 мг полимера, выделенного на предыдущем занятии, перенести
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.2. ИИФЧЕОИЕ СБТРСЕЕЕМЕОИа НПМЕЛФМаСОЫЦ НБТТ ВИПРМБТУИЛПГ НЕУПЕПН ДЕМЭ
ХИМЭУС
БЦИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
в мерную колбу на 50 мл, добавить в колбу 10
15 мл хлороформа и после
растворения полимера довести хлороформом объем до ме
тки.
2. Таким же способом приготовить 0
1 % растворы полистерола с ра
ной молекулярной массой
от 50
000 до 600
000 дальтон.
3. Приготовить элюент, в качестве которого служит обезвоженный и
перегнанный хлороформ, перед использованием хлороформ дегазируется
пропусканием через элюент инертного газа
гелия
4. Включить систему Бриз и задать программу хроматографирования
5. Ввести
через ручной инжектор 10 мкл стандартного раствора и дать
команду старт для проведения хроматографирования
6. После завершения хроматографирования стандартов записать пробу
полимера
7. Провести расчеты хроматограмм в соответствии с заданной кали
б−
ровко
8. Оформить результаты в виде графика распределения молекулярных
масс полимера.
1.
Какова и
стория открытия хроматографии
2.
Каковы п
ерспективы использования хроматографического метода
3.
акие в
иды хроматографии
различают
по агрегатному сос
тоянию
элюента
4.
Каковы
основные виды хроматографии в зависимости от природы
взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между эл
ентом и неподвижной фазой
Перечислить и охарактеризовать
их.
5.
В чем заключаются п
реимущества и достоинства
ВЭЕК
6.
Какой метод используется для исследования молекулярного распр
е−
деления полигидроксиалканоатов?
Цель работы
знакомство с методом газовой хром
атографии и масс
спектрометрии.
Газовая хроматография
(ГХ)
вид
хроматографии
, в которой подви
ной фазой служит
газ
(пар). Разделение компонентов в ГХ основано на ра
личии скоростей движения и размывани
кон
центрационных зон исследу
е−
мых веществ, движущихся в потоке газовой фазы относительно слоя непо
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
вижной фазы, причем эти вещества распределены между обеими фазами. Газ
носитель (воздух, Не, N
, Аρ, СО
и др.) должен обычно иметь небольшую
вязкость
и обеспечивать высокую чувствительность детектирования. Далее
приводятся основные характеристики ГХ.
Основные уравнения в газовой хроматографии
Коэффициент распределения
отношение концентраций исследуемого
со
единения в неподвижной и подвижной фазах в равновесных условиях:
K
c
(6.3.1)
Фазовое отношение
это отношение объемов подвижной и неподви
ной фаз в колонке:
под
неп
(6.3.2)
Фактор удерживания
фактор емкости
это отношение приведе
ных времен
удерживания к мертвому времени:
t
(6.3.3)
Фактор разделения
величина, характеризующая селективность ра
делительной системы, равная отношению факторов удерживания или прив
е−
денных времен удерживания двух соседних пиков на хроматограмме:
2/1
11
α==
(6.3.4)
Эффективность колонки
характеристика степени размывания полос
в колонке, характеризуется числом теоретических тарелок
или
0,5
5,545




(6.3.5)
где
0,5
ширина пика на половине высоты.
H
N
(6.3.6)
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
где
длина колонки;
безразмерная величина;
имеет размерность дл
ны обычно в м
иллиметрах
Разрешение R
это отношение расстояния между максимумами и
с−
следуемых соседних пиков к сумме их полуширин, выраженных в одних и
тех же единицах измерения:
12
s
bb
R
WW
(6.3.6)
Связь степ
ени разрешения с фактором разделения
α,
фактором удерж
вания
и эффективностью
(6.3.7)
Цисло тарелок, необходимое для полного разделения при
= 1:
(6.3.8)
при
> 10 это уравнение можно упростить:
(6.3.9)
На хроматографическое разделение (на величины
α, R
) влияют
многие факторы: п
рирода сорбента, д
лина и сечение колонки,
толщина жи
кой
пленки на носителе или на стенках капиллярной колонки.
ри небольших давлениях инертные газы
носители практически не а
сорбируются, особенно в газожидкостной хроматографии. Поэтому природа
газа
носителя практически не влияет на селективность разделения, з
а искл
чением некоторых случаев в газоадсорбционной хроматографии при разд
е−
лении газов на активных тонкопористых адсорбентах. В большинстве случ
а−
ев на входе в колонку используют избыточное давление в пределах от 0,1 до
2 атм (в очень редких случаях выше).
Изменение давления в этих пределах
практически не влияет ни на селективность, ни на эффективность разделения.
Размер введенной пробы анализируемой смеси должен быть таким,
чтобы не вызывать перегрузку колонки. При введении пробы больше макс
мально допусти
мой изменяются времена удерживания. Особенно важно не
перегружать капиллярную колонку, так как ее эффективность сильно падает
с перегрузкой.
Развитие высокоэффективной ГХ связано прежде всего с изобретением
капиллярных колонок. Первоначально капилляры выду
вались из стекла.
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Хрупкость таких колонок ограничивал
их использование. Появление гибких
колонок из кварца с инертной поверхностью дало толчок к развитию ГХ как
метода с большей эффективностью разделения по сравнению с насадочными
колонками, откуда и появ
ился термин
высокоэффективная газовая хромат
графия
Разработка программного обеспечения, производство колонок на
коммерческой основе привело к совершенствованию хроматографического
оборудования, что существенно расширило область применения газовой
хрома
тографии в науке и промышленности.
Схема современного газового хроматографа изображена на
рис. 6.


Рис. 6.
. Функциональная схема газового хроматографа
Для создания перепада давления через
колонку хроматограф подсоед
няют к источнику со сжатым газом
(баллонная или лабораторная линия со
сжатым газом). Церез колонку поток газа
носителя должен проходить с п
стоянной и определенной скоростью, поэтому на входе в колонку на линии
газа
носителя у
станавливают регулятор и стабилизатор расхода газа
носителя
и измеритель расхода газа
. Если газ
носитель загрязнен нежел
а−
тельными примесями, то в этом случае устанавливается еще фильтр
. В с
временных хроматографах используются блок подготовки газа с
электро
ным заданием и управлением расходов газов. Перед входом в колонку уст
а−
навливается устройство для ввода анализируемой пробы в колонку
дозатор
испаритель
. Обычно анализируемую пробу вводят микрошприцем
через
самозатекающее термостойкое резиново
е уплотнение в дозаторе. Анализ
руемая проба, введенная в дозатор, захватывается потоком газа
носителя и
направляется в хроматографическую колонку
. Детектор
зарегистрирует
присутствие разделенных компонентов в газе
носителе. Эти сигналы в случае
необх
одимости усиливаются (усилитель
) и регистрируются на шкале вт
ричного самопишущего прибора
или дисплея компьютера. Для обеспеч
е−
ния стабильного режима работы детектора используется блок питания дете
тора
. Сорбируемость веществ зависит от температур
ы. Для исключения
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
влияния колебания температуры на результаты разделения колонку помещ
ют в специальную камеру
термостат, температура которой устанавливается и
поддерживается терморегулятором
. В случае необходимости температура
колонки в процессе разделе
ния может изменяться по определенной програ
ме с помощью блока программирования температуры
. Высота или пл
щадь пика пропорциональны количеству или концентрации компонента
в смеси. Площадь пика может быть измерена с помощью электронного инт
е−
гратора
ли по специальной программе.
Всего для газовой хроматографии предложено более 60 типов детект
рующих систем.
Но к наиболее часто используемым относятся пламенно
ионизационный детектор, детектор по теплопроводности, электронно
захватный детектор, термоионн
ый детектор, пламенно
фотометрический д
е−
тектор, фотоионизационный детектор, масс
спектрометрический детектор.
Хромато
масс
спектрометры
одни из наиболее распространенных совр
е−
менных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкос
ных или ион
ных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предвар
тельное разделение вещества, а
индикацию
разделенных веществ и
измер
е−
ние
их
содержаний
осуществляет масс
спектрометр. Поэтому масс
спектрометры в хроматографии большей частью имеют дело не со смесью
со
единений, а с индивидуальными соединениями.
Масс
спектрометрия
(масс
спектральный анализ), метод анализа вещества путем определения
массы (чаще, отношения массы к заряду
m/z
) и относительного количества
ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества
или уже прису
ствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений
m/z
и относительных
величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, н
а−
зывается масс
спектром вещества. Масс
спектрометры устанавливают мол
е−
кулярную массу вещества, ее ато
марный и изотопный состав, а также пр
странственную структуру расположения атомов.
Как аналитический метод масс
спектрометрия обладает исключительно
высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества
органического вещества в больших объ
емах газов и жидкостей, а также в
биологических системах. С помощью масс
спектрометрии можно изучать
превращения вещества в процессе х
мической реакции, что существенно для
устано
ления ее м
ханизмов. Масс
спектроме
рия в соч
тании с газ
вой
хром
тографией
тивно и
пользуется в СФУ для решения ряда биотехнол
гических з
дач.
Для выполнения работы используется хромато
масс
спектрометр
Agileντ 5975Iνeρτ (Agileντ, СЧА)
рис. 6.8

МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Рис. 6.8.
Общий вид
хромато
масс
спектрометра Agileντ 5975Iνeρτ
Технические характеристики
хромато
масс спектрометра Agileντ
5975Inert
ромато
масс
спектрометрическая система представляет собой сов
купность самых современных технологий
. П
рименение химически инертных
материал
ов для изготовления источника ионизации позволяет практически
полностью устранить возможность разложения и деградации термолабил
ных соединений и получать в процессе масс
спектрометрического анализа
данные, максимально пригодные для идентификации по библио
текам масс
спектров.
В модели Agileντ 5975 Iνeρτ упрощена процедура настройки режима
химической ионизации: поток газов
реактантов управляется электронными
регуляторами, и настройка их оптимальных значений осуществляется в авт
матическом режиме практически
без участия оператора. К прибору может
быть одновременно подключено два газа
реактанта, их переключение осущ
е−
ствляется при помощи программного обеспечения. Возможность использ
вания источника химической ионизации для работы с ионизацией электро
ным ударом
позволяет программно переключать способ ионизации во время
анализа одной пробы.
Применение технологии QuickSwαπ дает возможность в считанные м
нуты производить замену аналитической хроматографической колонки без
выключения хромато
масс
спектрометра, пров
одить обратную продувку к
лонки для удаления тяжелых компонентов. Используя функцию eMeτhod,
оператор может загружать аналитические методы, разработанные компанией
Agileντ для анализа тех или иных групп химических соединений, непосредс
венно с интернет
сай
та
www.agilent.com


МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Программа выявления индивидуальных спектров позволяет находить и
идентифицировать целевые соединения в сложных матрицах даже в случаях,
когда эти вещества не имеют выраженного хроматографического пика.
истема управляется Химической станцией на базе современного
компьютера, работающего в среде Ωiνdowσ XP. Управление хроматографом
и детектором осуществляется посредством LAN коммуникации.
В стандартный комплект входят программы автоматической настройки,
рограммы сбора и обработки данных, включая библиотечный поиск масс
спектров и распечатки отчетов о различных форматах. Для удобства обсл
живания и ухода за системой имеется комплект стандартных диагностич
е−
ских программ. Дополнительно включены библиотеки ма
сс
спектров NIST
05 (190 825 соединений) со структурными формула
ми, ΩiLey (621 600 с
единений).
Технические характеристики масс
селективного детектора:
диапазон масс от
1,6
1050 а.е.м.,
параметры могут быть выбраны внутри этого диапазона;
максимальная
скорость сканирования составляет 10
000 а.е.м./с.
Рекомендуемая скорость сканирования составляет 800
1600 а.е.м./с,
что позволяет получать два или три спектра в секунду.
Цувствительность при ионизации электронным ударом, режим скан
рования
1 пикограмм октафторнафталина при введении в 1 мкл изооктана и
использовании стандартной колонки HP
5MS 0
мм
мкм дает
отношение сигнал/шум не хуже 200:1 на отдельной хроматограмме по массе
m/z 272.
Цувствительность при ионизации электронным
ударом, режим рег
страции отдельных ионов
20 фемтограмм октафторнафталина при введении
в 1 мкл изооктана и использовании стандартной колонки HP
5MS
мм
мкм дают отношение сигнал/шум не хуже 50:1 на отдел
ной хроматограмме по массе µ/z 272.
Система Agileντ 6890/5975 Iνeρτ работает при объемной скорости пот
ка газа
носителя (гелия или водорода) до 2 мл/мин при использовании ста
дартного турбомолекулярного насоса, до 4 мл/мин при использовании выс
коэффективного турбомолекулярного насоса (262
л/с) и колонок с внутре
ним диаметром 0
32 мм.
Применение химически инертных материалов для изготовления исто
ника ионизации позволяет практически полностью устранить возможность
разложения и деградации термолабильных соединений и получать в процессе
масс
спектрометрического анализа данные, максимально пригодные для
идентификации по библиотекам масс
спектров.
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель работы
знакомство с методом газовой хроматографии и масс
спектрометрии.
Материалы и оборудование:
ипидный экстракт из
Ralstonia
eutroph
5786
еактивы: хлороформ, этанол, метанол, концентрированная серная к
слота, гексан, бензол, дистиллированная вода, натрия сульфат безводный
абораторная посуда: грушевидные колбы на 50 мл, пипетки, обратные
холодильники, воронки, делительные воронки
, пробки, шприц хроматогр
а−
фический на 10 мкл
абораторное оборудование: роторный испаритель
Rotovapor
210/
Buchi
, Германия), водяная баня, хромато
масс
спектрометр Agileντ 5975Iνeρτ
(Agileντ, СЧА).
Ход работы:
1.
Приготовление метиловых эфиров ЕК
риготовить смесь из 10 мл метанола и 0
2 мл концентрированной
серной кислоты
добавить в колбу к осушенным липидам 2
3 капли бензола и 0
5 мл
метанольной смеси
нагреть водяную баню до 90
С, подключить водяное охлаждение к
обратным холодильникам,
установить колбу на шлиф холодильника и поме
с−
тить нижнюю часть колбу (1/2
1/3) в воду
длительность метанолиза составляет1,5
2 ч, в течени
этого времени
необходимо наблюдать за охлаждением, температурой в бане, целостью ко
бы и пр.
по окончании проце
сса снять колбу, добавить 1 мл дист
илированной
воды и 2 мл гексана, интенсивно встряхнуть несколько
раз
перелить смесь в делительную воронку, добавить 5 мл дист
илирова
ной
воды, слить из воронки нижний водный слой, повторно добавить и слить
5 мл дист
или
рованной
оды
верхний слой, состоящий из гексана с растворенными метиловыми
эфирами ЕК, пропустить через слой Nα
SO
в грушевидную колбу, затем и
с−
парить гексан на роторном испарителе так, как описано ниже
готовые метиловые эфиры ЕК хранить в
морозильной камере неп
средственно до проведения газовой хроматографии.
2.
Выпаривание гексана:
подключить вакуум, водяное охлаждение к роторному испарителю,
отрегулировать температуру водяной бани в пределах 35
40
поместить колбу с экстрактом на с
теклянный выход
шлиф испарит
е−
ля, закрыть герметизирующий кран и включить вращение колбы
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
по окончании испарения растворителей из колбы выключить вращ
е−
ние, открыть герметизирующий кран, снять колбу, отключить вакуум и о
лаждение.
3.
Подготовка газового х
роматографа к выполнению анализов
ткрыть газовую линию (гелий) и проверить ее на герметичность
включить хроматограф, масс
спектрометр, запустить управляющую
компьютерную программу
дождаться прогрева вакуумного насоса, установить температурный
реж
им всех блоков хроматографа, через 4 ч работы провести тестирование и
настройку детектора с помощью программного обеспечения
при успешном результате тестирования прибор готов к работе.
4.
Газовая хроматография метиловых эфиров ЕК
выбрать нужный метод
проведения анализа из имеющихся, устан
вить режим ввода пробы 
split
, т
сть
с делением потока газа при вводе
пробы
заполнить данные о пробе при формировании файла, где будут хр
а−
ниться результаты анализа
в колбу с метиловыми эфирами с помощью микр
ошприца добавить
40 мкл гексана, смыть и сконцентрировать вещество на дне колбы, по
окончании отобрать шприц
м 1
3 мкл раствора
запустить анализ пробы из компьютерной программы, дождаться
сигнала готовности прибора, ввести пробу в инжектор
проце
сс хроматографии происходит далее около 1 ч, за это время
введенные метиловые эфиры ЕК разделяются на колонке, подаются в масс
спектрометрический детектор, где производится регулярное сканирование
спектров вещества, выходящего из колонки, спектры и общая и
онная инте
сивность записываются в соответствующий файл.
5.
Идентификация пиков метиловых эфиров ЕК
по окончании анализа возможна работа с сформированным файлом
пробы с помощью специальной программы обработки данных
провести идентификацию пиков на хр
оматограмме путем сравнения
масс
спектров веществ с имеющимися в базе данных
рассчитать процентное содержание основных жирных кислот от их
общей суммы
занести данные в таблицу
провести сравнение результатов с литературными данными.
1.
чем заключается принцип действия газовой хроматографии, как
вы основные функциональные блоки газового хроматографа?
2.
В чем заключается п
ринцип метода масс
спектрометрии
3.
Для чего необходимо образование метиловых эфиров жирных кислот
перед выполнением
газохроматографического анализа?
МОДУЛЫ 6. СОВРЕМЕННЫ
Е МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИ
Ю ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Сбвпуб 6.3. ИТТМЕЕПГБОИЕ ТПТУБГБ ЗИСОЫЦ ЛИТМПУ МИРИЕПГ, ГЫЕЕМЕООЫЦ НЕУПЕПН ЦСПНБУП
НБТТ
ТРЕЛУСПНЕУСИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
4.
Как происходит формирование и запись масс
спектров веществ в д
е−
текторе прибора, каковы основные блоки масс
спектрометрического дете
тора квадрупольного типа?
5.
Какую информацию о структуре молекулы ЕК можно получить с
помощью масс спектрометрии?
6.
Какие ЕК являются наиболее распространенными у бактерий?
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
знакомление с основными принципами, используемыми при
конструировании и эксплуатации оборудования биотехнологических пр
цессов
Задачи:
ознакомление с принципами составления материально
энергетического
баланса проце
ссов микробного роста и синтеза продуктов;
определение и расчет массообменных характеристик ферментационн
го оборудования;
определение величины и роли межфазной поверхности в системе газ
жидкость в ферментерах различных конструкций.
Аппаратурное оформление технологических процессов производства
продуктов биотехнологии и, прежде всего, микробиологического синтеза
весьма разнообразно и во многом специфично. Специфические требования к
оборудованию биотехнологической промышленности связан
ы с санитарно
гигиеническими вопросами и предотвращением контаминации, что имеет
решающее значение при проектировании. В этой связи одним из основных
требований к оборудованию микробиологического производства является его
герметичность. Применение герметич
ных аппаратов, особенно для стадии
культивирования биологических объектов,
важн
условие качественного
проведения процесса и получения стандартного продукта с высоким вых
дом. Большое значение имеет правильный выбор материала, из которого и
готовлено об
орудование, поскольку компоненты материала могут оказывать
как активирующее, так и ингибирующее действие на биосинтез биологически
активных веществ. Еще одним важным требованием к оборудованию для
биотехнологии является необходимость обеспечения высокой пр
оизвод
тельности. Цем больше производительность аппарата, тем меньше требуется
сложных автоматических приборов контроля и регулирования параметров
процесса, запорной аппаратуры, трубопроводов и др. Оборудование должно
быть рассчитано на проведение непрерыв
ных процессов, поскольку это со
дает возможность интенсифицировать и автоматизировать биотехнологич
е−
ские процессы.
Важной особенностью биотехнологии является проведение основной
технологической стадии (стадии ферментации) в водной среде, при постоя
ном пер
емешивании и вибрации, а также меняющихся параметрах (рН, те
м−
пературы, ионной силы среды и др.). Эти обстоятельства предопределяют
схожесть процессов приготовления питательных сред для микроорганизмов,
проведения биосинтеза и выделения целевых продуктов и
обуславливают
создание универсальных установок, позволяющих осуществлять без серье
ной переналадки большое количество процессов, производящих ценные пр
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
дукты. Биотехнологическая установка (
ферментер, биореактор
) состоит из
стандартных
модулей
, реализующих
типовые операции. Их конкурентосп
собность по сравнению с установками, проектируемыми конкретно для з
а−
данного технологического процесса, определяется тем, что в них заранее з
а−
ложена возможность быстрой замены технологий в широком диапазоне в з
а−
висимости от
меняющихся потребностей рынка. Это сокращает вынужде
ный простой установки и связанные с ним нерациональные накладные ра
ходы. Использование
модульного принципа
в биоинженерии позволяет д
биться высокой степени заводской готовности оборудования и снижает

а−
траты на его изготовление и монтаж. Модульный принцип также предусма
ривает разработку и использование типовых алгоритмов и программ опт
мального управления оборудованием, модулей с использованием микропр
цессоров, а также пакета программ
оптимального
для управления выбра
ными технологическими процессами. Использование возобновляемого сырья
с одновременным производством ценных, например кормовых
препаратов
существенно снижает себестоимость получаемого продукта, что также п
вышает конкурентоспособность
модульных линий, а их малая мощность о
легчает обеспечение ее экологической безопасности. Кроме того, предлага
мое сырье и процесс его подготовки предусматривают полную утилизацию
твердых отходов, концентрирование и использование стоков, и возврат ко
денс
ата от их упаривания в технологический процесс. Модульные линии
имеют определенные перспективы для выхода на международный рынок, п
скольку есть достаточное количество средних и малых стран, испытывающих
потребность в препаратах, но не имеющих достаточных
средств для создания
крупных предприятий. Однотипность модулей позволяет объединять их в с
е−
ти, в которых отдельные функции линии могут быть сосредоточены в сп
циализированных подразделениях.
Важнейшей задачей биотехнологического производства является пол
ение максимального выхода целевого продукта. Для достижения этой цели
процесс ферментации должен проходить в оптимальных условиях, которые
создаются с помощью ферментационного оборудования и той инфраструкт
ры, которая обеспечивает его функционирование. В
этой связи на первый
план выдвигаются задачи, связанные с устранением заражения культуры п
сторонней микрофлорой и обеспечения качественного управления процессом
культивирования. Заражение культуры микроорганизмов или клеток пост
ронней микрофлорой приводи
т к прямым экономическим потерям, причем в
ряде случаев очень значительным. Поэтому при выборе ферментационного
оборудования в первую очередь обращают внимание на надежность обесп
е−
чения асептики процесса культивирования. Другое важное требование отн
сится
к процессу стерилизации питательной среды. Питательная среда не
должна быть перегрета при тепловой стерилизации, что приводит к дес
рукции таких ее компонентов
как витамины и аминокислоты, а результатом
этого становится замедление роста культуры и паде
ние продуктивности.
Стерилизация питательной среды должна проводиться в автоматическом р
е−
жиме. Практика показывает, что ошибки оператора являются главной прич
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
ной отсутствия стерильности питательной среды. Процессы, протекающие
при ферментации, требуют неп
рерывного управления.
Цель работы: э
кспериментально подтвердить закономерность между
тепловыделением
клеточной популяции и ее потреблением кислорода.
Точное измерение количества метаболического тепла связано с серье
ными техническими трудностями. Имеет место противоречие между треб
ванием контролируемости условий роста и специфическими требованиями
корр
ектности калориметрических измерений. При культивировании помимо
метаболического тепла генерируется тепло техническое, связанное с аэрац
ей, перемешиванием и теплопотерями. Сам процесс калориметрии измерения
требует законченности переходных процессов по те
пловым потокам в объе
те и окружающ
м его оборудовании. Таким образом, чем лучше проба подг
товлена к калориметрическим измерениям, тем больше условия в клетках о
личаются от истинных,
поскольку
наблюдается лимит как по газовому, так и
органическому субстр
атам. Более перспективны в этом плане измерения,
проводимые не с образцами, а с целым ферментером. Но в этом случае то
ност
измерения
меньше
, чем при измерении тепла химических реакций.
В этой связи более целесообразно использовать аналогию между выделени
ем
культурой тепла и потреблением ею кислорода. Такой зависимостью
является средне
значение коэффициента пропорциональности
= 103
68 кДж/экв
, которое справедливо на протяжении всего жизне
ного цикла клеток и
не зависимости от их возраста.
Метаболич
еское тепловыделение согласно [
] включает
где
удельная скорость тепла в расчете на 1 экв.
энтальпии
в субстрате, биомассе и продуктах.
При
уравнение имеет вид
Степень точности последнего выражения тем больше, чем ближе друг к
другу величины энтальпии, то есть когда образуется меньше продуктов мет
а−
болизма
и чем бо
льше редоксонов субстрата уходит на кислород.
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.1.
ИТТМЕЕПГБОИЕ УЕРМПГЫЕЕМЕОИа И РПУСЕВМЕОИа ЛИТМПСПЕБ РСИ СПТУЕ ВБЛУЕСИК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Показанная пропорциональность между тепловыделением и дыханием
при аэробном росте имеет место при росте на любом органическом субстр
а−
, т
ак как конструктивный обмен протекает приблизительно на постоянном
энер
гетическом уровне, а дыхательный обмен опускает редоксоны со ста
дартного уровня, имеющего место в органических соединениях до нуля.
Поэтому в случае аэробного роста в отсутстви
большого количества
продуктов метаболизма целесообразнее тепловыделение клетк
ами измерять
через скорость потребления кислорода.
В этой связи тепло
, которое получила культуральная жидкость за
время отключения системы термостатирования, можно представить в виде
баланса
б
где
тепло
выделяемое клетками, Дж/
тепло
выделяемое перемешивающим устройством при постоянной
мощности, Дж/
потери тепла в окружающую среду, Дж/
Тепло
выделяемое в окружающую среду
определя
тся экспериме
тально с использованием стандартного нагревателя при
калибровке в пит
а−
тельной среде без клеток. Аналогично тепло
выделяемое перемешивающими
устройствами
также определяется опытным путем. Например, тепло выд
ляемое турбинной мешалкой биореактора
BioFlo
110 при 1200 об/мин и ди
а−
метре мешалки
80 мм
составляе
т 18
20 Дж/
. Тепло в рабочем объеме би
реактора
определяется на основании начальной и конечной температуры
среды достигаемо за время отключения системы термостатирования.
Таким образом, из теплового баланса определяется скорость теплов
деления клеток
Дж/ч, а при помощи газоанализаторов скорость потребления
кислорода
, моль
/ч. После чего величина скорости потребления кисл
рода переводится в экв.редоксонов в час из расчета 4 экв.
/моль
. На
основании полученных данных определяется отношение с
корости теплов
деления к скорости дыхания
. кДж/экв.
, которое составляет [
103,7 кДж/экв.
Материалы и оборудование:
ультура штамма
. eutrophus
5786;
аствор базового фосфатного
буфера для среды;
терильные растворы микроэлементов, железа лимонно
кислого, сул
фата магния и хлористого аммония;
становка для гетеротрофного культивирования
включающая тепл
изолированный биореактор с турбинной мешалкой
BioFlo
110 и устройство
для термо
стабилизации подаваемого воздуха и насыщения его водяным п
а−
ром;
азоанализатор для измерения концентрации кислорода;
ермометр
Beckmann
(точность 0,01
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.1.
ИТТМЕЕПГБОИЕ УЕРМПГЫЕЕМЕОИа И РПУСЕВМЕОИа ЛИТМПСПЕБ РСИ СПТУЕ ВБЛУЕСИК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Ход работы:
1. Определить
потери тепла в окружающую среду;
2. Определить
тепло
выделяемое перемеш
ивающим устройством;
3. Определить
тепло
выделяемое клетками
4. Провести статистическую обработку экспериментальных данных и
рассчитать отношение
, кДж/экв.
5. Сравнить полученные значения с известными в литературе данными
и сделать выводы.
1.
Какие м
етоды измерения тепловыделения микроорганизмов
вы зн
а−
ет?
акова с
вязь редоксона с количеством потребленного ки
лорода
3.
В каком виде представляют т
епловой баланс биореактора
Цель работы
: приобретение навыков определения величины коэфф
циента массоотдачи в газожидкостном биореакторе.
Перенос
газового субстрата (кислорода) через жидкость характеризуе
ся общеизвестным уравнением
*
c
a
d
dc
G
где
скорость сорбции (переноса), растворенного
(моль
поверхностный коэффициент массоотдачи (переноса), м/
объемный коэффициент массоотдачи, с
межфазная поверхность контакта, м
равновесная концентрация
в жидкости, моль
/л;
текущая концентрация кислорода в жидкости, моль
/л.
Коэффициент массопереноса
рассматривают как масштабный пар
а−
метр
необходимый для поддержания функционирования биореактора и п
лучения наибольшей продуктивности процесса.
Наилучшую сходимость расчетных значений
с опытными в лабор
а−
торных биореакторах дает уравнение типа [

МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.2. ПРСЕЕЕМЕОИЕ ГЕМИЧИОЫ ЛПЭХХИЦИЕОУБ НБТТППУЕБЧИ Г ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
0,6
0,5
0,33
(/)
ndd
ScDd
где
средний диаметр пузырьков газа, м;
коэффициент кинематической вязкости жидкости, м
поверхностный коэффициент массоотдачи, м/с;
ритерий Червуда;
критерий Чмидта.
Изменение концентрации растворенного газа в культуре с учетом его
потребления клетками и поступления его из газовой фазы представляют в
виде
где
удельная скорость потребления газа биомассой,
кг
кг
концентрация биомассы,
кг/м
В стационарном состоянии
= 0, и тогда
При равенстве количества газа, поступающего из газовой фазы в жи
кость и потребляемого
микроорганизмами
имеем
/(
Если
выполняет роль лимитирующего субстрата
можно записать
уравнение Михаэлиса
Ментена в виде
мак
где
удельная скорость поглощения
отнесенная к весу сухих клеток,
ммоль
/г клеток
мак
максимальная скорость поглощения кислорода,
ммоль
/г клеток
константа.
Так
например, согласно [
] удельная скорость потребления компоне
тов газовой
смеси (
) растущей и аккумулирующей полимеркул
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.2. ПРСЕЕЕМЕОИЕ ГЕМИЧИОЫ ЛПЭХХИЦИЕОУБ НБТТППУЕБЧИ Г ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
турой
Ralstonia eutropha
при периодическом культивировании
на первой ст
а−
дии составляет для водорода 0
036
04, кислорода 0
18, диоксида угл
е−
рода 0
14 кг/(кг
ч). На стадии накопления ПГА
в безазотной среде ск
рость потребления газа существенно уменьшается, что обусловлено сниж
нием роста клеток. При этом
экономический коэффициент культуры в сре
нем на первом этапе культивирования составляет: по
5 кг АСБ /кг;
34;
48,
на втором этапе, соответственно
9; 0
2; 0
4. Среди микр
организмов существуют значительные различия в потребности
Для определения скорости поглощения кислорода используются в о
с−
новном четыре метода: динамический; сульфитный; прямое измерение и те
тический расчет, учитывающий рост биомассы.
Динамический метод осуществляется в периодической ферментации
путем измерения скорости снижения концентрации газа в жидкости после
прекращения аэрации и построения линейной зависимости, величины
снижения
концентрации кислорода от времени. Угол наклона построенной
прямой линии определяет обратную величину объемного коэффициента ма
с−
соотдачи
Сульфитный метод заключается в том, что в присутствии 10
молей
или С
сульфит натрия окисляет растворе
нный кислород. Затраченный
сульфит определяют путем добавки раствора йода, а остаточный йод титр
ют
тиосульфатом. Однако метод не дает представления о динамике обе
печения жидкости кислородом, а характеризует только условия аэрации.
Определение скорост
и переноса кислорода можно реализовать по и
мерению микробного роста в аэробных услови
:



Y
A
где
потребление кислорода, моль
/г сухих
клеток;
количество кислорода
необходимое клеткам для окисления 1 г су
страта до
количество кислорода
необходимое для окисления 1 г сухой би
массы в
экономический коэффициент, г биомассы/ г субстрата.
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.2. ПРСЕЕЕМЕОИЕ ГЕМИЧИОЫ ЛПЭХХИЦИЕОУБ НБТТППУЕБЧИ Г ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Величин
определяется в результате теоретических расчетов окисл
ния субстрата и В = 400
590 мл
/ г сухих клеток
опытная величина.
Для определения общего количества кислорода, которое требуетс
культуре за
ч, необходимо знать удельную скорость роста
, ч
; коэфф
циент
, г клеток/ г
K
x
N
где
общее количество кислорода
необходимое культуре за 1 ч;
корректирующий фактор, молей

Для определения
используют следующее уравнение:
200
933
600
1600
2
2
16
1
H
N
C
O
M
Y
O
/
H
C
Y
o
где
число атомов углерода, водорода и кислорода в субстрате;
N
,
O
,
H
,
проценты углерода, водорода, кислорода и азота в би
массе;
молекулярный вес субстрата.
Расчет объемных значений коэффициента массоотдачи при физической
сорбции обычно проводят по опытным данным, полученным при насыщении
дистиллированной воды кислородом из воздуха
по уравнению
ln
где
концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м
с*
равновесная концентрация кислорода в жидкости, кг/м
коэффициент, определяемый из начальных условий;
время насыщения, с;
объемный коэффициент массоотдачи,
Величина коэффициента
определяется из начальных условий (
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.2. ПРСЕЕЕМЕОИЕ ГЕМИЧИОЫ ЛПЭХХИЦИЕОУБ НБТТППУЕБЧИ Г ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
e
/
*
c
A
где
начальная концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м
При приготовлении рабочей смеси жидкость обескислороживается п
тем пропускания
через нее азота либо за счет создания в аппарате вакуума
с последующей дегазацией.
Материалы и оборудование:
ультура штамма
. eutrophus
5786;
терильный раствор базового фосфатного буфера для среды;
терильные растворы микроэлементов, железа лимонно
кислого, сул
фата магния и хлористого аммония;
становка для гетеротрофного культивирования
включающая биореа
тор с турбинной мешалкой
BioFlo
110;
азоанализатор для измерения концентрации кислорода.
Ход работы:
1. Определить концентрацию биомассы в
рабочем объеме биореактора
2. Установить удельн
скорост
поглощения
3. Используя полученные экспериментальные данные
провести расчет
объемного коэффициента массоотдачи
4. Определить продуктивность биореактора по биомассе.
1.
Каковы с
пос
обы определения коэффициента массоотдачи в биореакторе
2.
ак выразить с
вязь объемного и поверхностного коэффициента ма
с−
сопередачи
3.
Какой
биореактор
аиболее эффектив
с позиции массопереноса
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Цель работы
определение газосодержания, диаметра пузырьков газа
и межфазной поверхности в аппаратах с
мешалкой и в пленочном.
Величина межфазной поверхности позволяет оценить массообменные
параметры биореактора и осуществлять переход от поверхностного коэфф
циента массоотдачи к объемному.
Если в объеме
, заполненном газожидкостной смесью, имеется
а−
вых пузырьков осредненного диаметра
, то их поверхность составит
=
, а их объем
/6, от
сю
да можно записать
Поделив левую и правую части последнего выражения на
получим
6. Из этого следует, что удельная межфазная поверхность
контакта фаз (поверхность газовых пузырьков в 1 м
смеси)
p
V
6
где
удельная межфазная поверхность контакта, м
газосодержание.
Доля газа в объеме жидкости обычн
о определяется
так:
где
объем газожидкостной смеси в биореакторе,
объем жидкости в биореакторе,
Среднеповерхностный диаметр пузырьков газа
i
i
d
n
d

МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.3. ПРСЕЕЕМЕОИЕ НЕЗХБИОПК РПГЕСЦОПТУИ Г
ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
количество пузырьков, шт.;
диаметр пузырька, м.
В лабораторных биореакторах с мешалками величина газосодержания
рассчитывается из соотношения
0,25
0,8
(1)
Ku
ρµ−φ



Для лопастной мешалки при
≤ 10 (кВт/м
) :
= 0,8;
= 0,5;
= 0,62;
= 0. Для турбинной мешалки при
≤ 10:
= 0,65;
= 0,5;
= 0,6;
0,65, при
� 10:
= 0,17;
= 0,1;
= 0,2;
0,65.
Среднеповерхностный диаметр пузырьков газа в рассматриваемых а
паратах при
(1
10
в биореакторе с лопастной мешалкой составляет
6 мм,
для турбинной мешалки
4 мм.
Наилучшую сходимость экспер
ментальных значений диаметра пузырька газа с рас
четными дает завис
мость типа [

0,6
0,4
0,2
0,8
NV




Удельная межфазная поверхность рассчитывается
0,4
0,2
0,5
0,6
1,44












где
газосодержание;

мощность на перемешивание, Вт;

рабочий объем биореактора, м

уровень жидкости в аппарате, м;

внутренний диаметр корпуса аппарата, м;

среднерасходная скорость воздуха, м/

плотность суспензии, кг/м

коэффициент динамической вязкости суспензии, Па

поверхностное натяжение жидкости
Н/м.
МОДУЛЫ 7. ИНЕЕНЕРНЫЕ
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Сбвпуб 7.3. ПРСЕЕЕМЕОИЕ НЕЗХБИОПК РПГЕСЦОПТУИ Г
ДБИПЗИЕЛПТУОПН ВИПСЕБЛУПСЕ
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Данные по межфазной поверхности в пленочном биореакторе пре
ставлены в работе [
Материалы и оборудование:
иореактор с турбинной мешалкой
BioFlo
110;
рубчатая насадка пленочного биореактора;
истема отбора газожидкостной смеси и уровня жидкости в аппарате;
ермометр
Beckmann
(точность 0,01
ифровой фотоаппарат.
Ход работы:
1. Определить газосодержание в биореакторах
2. Определить при
помощи фотографирования диаметр пузырьков
в культуре
3. Рассчитать удельную межфазную поверхность
4. Провести анализ и сделать выводы
Каково
азначение межфазной поверхности при масштабировании
биореакторов
Какие с
пособы определения
газосодержания
вы знаете?
Какие р
асчетные зависимости
используются
для определения гидр
динамических параметров в биореакторе с мешалкой
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
1.
Большой практикум по биотехнологии
чеб
пособие / Т.
Волова,
Кожевников, Л.
Франк
и др.
Красноярск
Краснояр.
гос.
т, 2005.
128 с.
2. Винаров
Э. Ферментационные аппараты для процессов микр
биологического синтеза
Винаров, Л.
Гордеев, А.
Кухаренко,
Панфилов
од ред
Быкова.
М.
ДеЛи Принт, 2005.
278 с.
3.
Волова
Г. Биотехнология
Волова.
Новосибирск
во
СО РАН
1999
252 с.
Волова
Г. Полиоксиалканоаты
биоразрушаемые полимеры
для медицины
Волова, В.
Севастьянов, Е.
Чишацкая.
Новос
бирск
Наука
2003.
Войнов
А.
Пленочные биореакторы
Войнов
Сугак,
Николаев, С.
Воронин.
Красноярск
во Боргес, 2001.
252 с.
Войнов
А. Пленочные трубчатые газо
жидкостные реакторы
А. Войнов
А. Николаев
Казань
Отечество
2007.
271
с.
7.
Высоцкий
С. Кальций
регулируемые фотопротеины морских к
шечнополостных
Высоцкий, С.
Маркова, Л.
А. Франк
//
Молек
лярная биология
2006
С.
, 404
417
Гладков
А. Биотехнологические методы получения растений, у
с−
тойчивых к
тяжелым металлам. Оценка комплексной фитотоксичности тяж
е−
лых металлов и получение растений, обладающих комплексной устойчив
стью //
Биотехнология
Гладков
Гладкова
2007
. 81
9.
Глик, Б.
Молекулярная биотехнология. Принципы и применение
Б. Глик, Дж. Пастернак.
. :
Мир
2002.
10.
Другов, Э.
С. Газохроматографическая идентификация загрязне
ний воздуха, воды, почвы и биосред / Э.
С. Другов, И.
Г. Зенкевич, А.
А. Р
дин.
: Бином, 200
5.
752 с
БИБЛИОГРАФИЦЕСКИИ С
ПИСОК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
11.
Егорова
А. Основы биотехнологии / под ред. Т.
Егоровой,
М. Клуновой, Е.
А. Еивухиной.
: Академия, 2003.
208 с.
12.
Еимулев
В. Общая и молекулярная генетика
чеб
пособие
И. В. Еимулев
е изд
Новосибирс
Сибирское университетское изд
тельство
2006
479 с.
13.
Зобова
В. Использование биотехнологических методов в пов
шении соле
и кислотоустойчивости ярового ячменя
Зобова, Е.
нышева.
Новосибирск
: СО Россельхозакадемия
2007.
124 с.
Использование биотехнологических методов в генетико
селекционных исследованиях плодовых и ягодных культур
Савельев,
Тюленев, Н.
Солоновых
и др.
// Сельскохозяйственная биология
2003.
0.
63.
15.
Квеситадзе, Г. И.
Введение в биотехнологию /
Г. И. Квеситадзе,
А. М. Безбородов /
РАН. Ин
т биохимии им. А. Н. Баха.
М. : Наука, 2002.
283 с.
16.
Клонирование ДНК (методы) /под ред
Д. Гловера.
Мир
1988
17.
Максимов
Теоретические и практические аспекты
использ
вани
биотехнологии и генной инженерии
Максимов
: Вузовская
книга, 2004.
18.
Минкевич
Г. Материально
энергетический баланс и кинетика
роста микроорганизмов
/ И. Г. Минкевич
Москва
Ижевск
: НИЦ Рег
лярная и хаотическая динами
ка
; институт компьютерных исследований,
2005.
352 с.
19.
Отто, М. Современные методы аналитической химии /
М. Отто.
: Техносфера, 2003.
Т. 1.
412 с.
20.
Отто, М
Современные методы аналитической химии /
М. Отто.
: Техносфера, 2003.
Т.
2.
281 с.
21.
Очерки экологической биофизики
под ред. Т.
Воловой.
Нов
сибирск
Изд
во СО РАН, 2003.
22.
Першина
А. Основные методы культивирования iν viτρo в би
технологии растений
: учеб.
особие
Першина
е изд., перераб. и
доп.
Новосибирск
: Новосиб.
гос.
т, 2005.
142 с.
БИБЛИОГРАФИЦЕСКИИ С
ПИСОК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
23.
Репин
В. Медицинская клеточная биология
Репин
Сухих.
М., 1998.
24.
Сазыкин
Биотехнология
/
Сазыкин, С.
Орехов,
Цакалева.
: Академия
2006
256 с.
25.
Сельскохозяйственная биотехнология
:
чеб. /
под ред. В.
С. Чев
е−
лухи
: Высш. шк.
2003.
469 с.
26.
Современные проблемы и методы биотехнологии
учеб
пособие
/
Н. А. Войнов и [др.]
Красноярск : ИПК СФУ, 2009.

Современные
проблемы
и методы биотехнологии
: УМКД № 1323
2008 /
рук. творч. ко
лектива Т. Г. Волова)
Сычев
Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография
на микроколоночных хроматографах серии Миллихром
чеб
пособие
Сычев
Сычев, В.
Гаврилина
Орел
2002.
258 с.
28.
Суриков
Т. Масс
спектрометрия с индуктивно связанной пла
мой. Образование ионов
/ В. Т. Суриков
Екатеринбург
: УрО РАН, 2006.
276 с.
29.
Торчилин
П. Иммобилизованные ферменты в медицине
В. П. Торчилин
ВНТИЦ, 1998
198
с.
30.
Трансгенные растения для фармакологии
Б.
Рукавцова, Ю.
Бурьянов, Н.
Чульга, В.
Быков
Вопросы биологической, медици
ской и фармацевтической химии
2006.
№ 2.
12.
31.
Чтильман
И. Полимеры медико
биоло
гического назначения /
М. И. Чтильман.
ИКЦ Академкнига
2006
399 с.
Boehm R. Bioproduction of therapeutic proteins in the 21st century and
the role of plants and plant cells as production platforms.Ann.NY Acad.
Sci, 2002,
V.1102(1),
P.121
134.
www.biotechnolog.
Bajji M. Bertin P., Lutts S., Kinet J
M.
Evaluation of drought
resistance
related traits in durum wheat somaclonal lines selected in vitro // Australian Jou
nal of Experimental Agricu
lture.
2004.
44.
. 27
БИБЛИОГРАФИЦЕСКИИ С
ПИСОК
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн
Birsin M. A., Özgen M. A. Comparison of callus induction and plant r
e-
generation from different embryo explants of triticale (x Triticosecale Wittmack)
Cellular & Molecular Biology Letters Volume 9, (2004)
353
361
Lutts S., Almansouri M., Kinet J.
M. Salinity and water stress have co
trasting effects on the relationship between growth and cell viability during and a
ter stress exposure in durum wheat callus
Plant Science 167 (2004) 9
Тпгсжнжооьж р
спвмжнь й нжупеь вйпужцопмпдйй.
бв. рсблуйлфн

Приложенные файлы

  • pdf 26707376
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий