Текстовая часть ВКР


МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
Вятский государственный университет
Институт биологии и биотехнологии
Кафедра микробиологии
Допускаю к защите
Заведующий кафедрой микробиологии
д.м.н., профессор
______________________________ Дармов И.В.
« » июля 2016 г.
Разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, предназначенного для ремедиации нефтезагрязненных почв
ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА МАГИСТРА
Разработала студент гр. мБМ-21 _________________ Коновалова Е.А.
« » июля 2016 г.
Руководитель
к.б.н., доцент _________________ Лазыкин А.Г.
« » июля 2016 г.
Нормоконтролер
д.м.н., профессор _________________ Погорельский И.П.
« » июня 2016 г.
Киров
2016
Содержание
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………...…...……… ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ……………………………………………………... 1 Обзор литературы…………………....................................……….….. 1.1 Нефть и нефтепродукты, как источник загрязнения окружающей среды……………………………………………… 1.1.1 Основные физические и химические свойства нефти и нефтепродуктов……………………………………..…… 1.1.2 Нефтяные загрязнение почв и их последствия……...… 1.2 Основные методы ликвидации нефтяных загрязнений……….. 1.2.1 Биоремедиация………………………………………...… 1.2.2 Фиторемедиация………………………………………..... 1.2.2.1 Растения, применяемые в фиторемедиации нефтезагрязненных почв……...……………….. 1.2.2.2 Технологии проведения фиторемедиационных мероприятий……………………………………. 1.2.3 Сочетание процессов био- и фиторемедиации. Составление растительно-микробной ассоциации …… 1.2.3.1 Получение микробного компонента………..… 1.2.3.2 Подготовка растительного компонента. Метод инокуляция семян растений-фиторемедиантов 1.2.4 Практическое применение растительно-микробных ассоциаций…………………………………………….... 1.3 Выводы по обзору научно-технологической и патентной информации……………………………………………………… 2 Выбор направлений исследований…………………………………… 3 Материалы и методы……………………………………………...…... 3.1 Микроорганизмы. Семена исследуемого растения…...…….… 3.2 Питательные среды, реактивы, расходные материалы……..… 3.3 Приборы и оборудование………...…………………………...… 3.4 Методы исследований………………………………………....... 3.5 Методы статистической обработки экспериментальных данных............................................................................................. 4 Экспериментальные исследования………………………...………… 4.1 Оценка морфологических и культуральных свойств микроорганизмов р. Pseudomonas и р. Rhizobium…………...… 4.2 Интенсификация фиторемедиационных процессов в почве загрязненной нефтью, с применением симбиотических бактерий рода Rhizobium в качестве стимулятора роста растения, а также микроорганизма – нефтедеструктора……… 4.2.1 Получение концентрированной суспензии микроорганизмов……………………………………...… 4.2.1.1 Оптимизация условий глубинного периодического культивирования исследуемых микроорганизмов
р. Pseudomonas и р. Rhizobium……….……… 4.2.1.2 Отработка условий концентрирования исследуемых микроорганизмов
р. Pseudomonas и р. Rhizobium ………………... 4.3 Разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, предназначенной для ремедиации нефтезагрязненных почв……………………..…… 4.3.1 Предпосевная обработка культурами микроорганизмов семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus)………..…………………………………….. 4.3.2 Общее влияние нефтяного загрязнения на рост и развитие микроорганизмов и используемых растений.. 4.4 Оценка нефтеокисляющей активности растительно-микробной ассоциации в процессе применения на нефтезагрязненной почве..…………………………………….... 5 Обсуждение результатов исследований…...………………………… 6 Практическое предложение………………………………………...… ВЫВОДЫ………………………………………………………………….. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ……...… СПИСОК ОПРЕДЕЛЕНИЙ И ТЕРМИНОВ………………………….… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………...… ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Задание на выполнение выпускной квалификационной работы……………………...… ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Авторская справка………………………….……… ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Доклад по дипломной работе………………...…… ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Презентация……………………………………...… ПРИЛОЖЕНИЕ 5 Отзыв руководителя……………………………..… ПРИЛОЖЕНИЕ 6 Рецензия……………………………………………. Введение
Среди большого количества проблем современного общества проблемы экологии встают в один ряд с такими глобальными проблемами как голод и эпидемии. В большинстве случаев они напрямую связаны между собой. Фактором, объединяющим их, так же является то, что человечество нуждается в скорейшем решении этих непростых задач, так они несут угрозу людям.
В настоящее время резко увеличились объемы добычи и транспортировки нефти [1]. Нефть и нефтепродукты являются самым распространенным источником топлива и энергии в мире и в связи с этим наиболее крупномасштабными загрязнителями окружающей среды. При существующих масштабах загрязнений и скорости естественного восстановления окружающей среды ауторемидиация может продолжаться до 30 лет, а в районах с холодным климатом гораздо дольше [2].
Существует много различных способов утилизации и переработки нефтепродуктов. К наиболее часто применяемым относятся физико-химические, биологические, химические и механические методы. Выбирая тот или иной способ утилизации, необходимо отдавать в первую очередь приоритет тем способам, которые направлены на получение углеводородного сырья из нефтешлама. Но проблема доочистки до сих пор не имеет решения. Использование комплекса мер с использованием различных методов очистки является наиболее перспективным способом [3].
Основную роль в ремедиации in situ (на месте загрязнения) играет биологический фактор – активность микроорганизмов, участвующих в процессах деградации углеводородов нефти и растений-фиторемедиантов [4,5]. Поэтому для наиболее эффективной ремедиации территорий, загрязненных углеводородами нефти, наиболее перспективно применять комплексные методы очистки, т.е. сочетать процессы фито- и биоремедиации. Благодаря совместному действию микроорганизмов и растений идет разрушение органических соединений в природе. Именно минерализация, происходящая с помощью микроорганизмов, является наиболее эффективной и экологически приемлемой для очистки окружающей среды от органических ксенобиотиков [3].
Одним из перспективных направлений в области очистки почв от нефтезагрязнения является применение биопрепарата на основе растительно-микробных ассоциаций - иммобилизованные на носителях клетки микроорганизмов нефтедеструкторов и клетки ризобий-симбионтов нефтетолерантных растений семейства бобовые. Преимущество метода заключается в повышении устойчивости клеток к действию неблагоприятных факторов внешней среды, в высокой каталитической активности клеток и их ферментов, в возможности повышать локальную концентрацию микробов в почве и избегать значительных потерь биомассы при использовании препарата. При выборе метода решено отдать предпочтение иммобилизации как варианту физического метода фиксации клеток. В качестве природных предлагается использовать семена растения-фиторемедианта из семейства бобовые Лядвенеца рогатого, являющиеся важным звеном при восстановлении загрязненного почвенного покрова. Данный подход позволяет реализовать два основных процесса: фиторемедиация и биоремедиация, которые должны активно осуществлять целевое воздействие на нефтепродукты в окружающей среде.
Объектом исследования является штамм микроорганизмов Pseudomonas delhiensis B-11400 - деструктор углеводородов нефти, штамм клубеньковых бактерий рода Rhizobium (Rhizobium lotus RL-5), семена Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus).
Целью настоящей работы являлась отработка условий и режимов культивирования и концентрирования биомассы штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 – деструктора углеводородов нефти и биомассы штамма клубеньковых бактерий рода Rhizobium, отработка основных принципов составления растительно-микробных ассоциаций, разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации.
1Обзор литературы
1.1 Нефть и нефтепродукты, как источник загрязнения окружающей среды
1.1.1 Основные физические и химические свойства нефти и нефтепродуктов
Нефть – это продукт природного происхождения, который попадает в биосферу исключительно только естественным путем. На сегодняшний день нефть выходит широко за пределы своей добычи с помощью перевозок в цистернах и танкерах, перекачек по трубопроводам, а потом начинается ее переработка в топливо и на нефтепродукты [1, 2]. Образующиеся отходы попадают в окружающую среду [3].
Есть опасность, что к завершению XXI века исчезнет все живое в океане, если загрязнение морей не прекратится. Особой опасности подвергается Средиземное море, где сильнее всего страдают от загрязнений широкие зоны побережий Франции и Италии. Купание на многих пляжах этих стран запрещено, так как загрязненная морская вода может привести к появлению тяжелых заболеваний [4, 5]. Аналогичная ситуация наблюдается и в водах Северного моря.
Точно такая же ситуация существует и на суше. При попадании вязкой нефти на почву, она просачивается в грунтовые подземные воды, там она переносится по направлению их течения и, таким образом, может распространяться на очень большие территории. Нефть по своей природе гидрофобна, и на поверхности воды она может образовывать тонкую пленку, и впоследствии такая воду уже становится непригодной для потребления [5, 6]. Нефть в комплексе с водой так же может образовывать эмульсионный слой на открытой водной поверхности, который в свою очередь способен препятствовать газообмену с воздухом, что в дальнейшем может привести к гибели всех живых организмов под пленкой. Морские птицы контактируют с нефтью и ведет к склеиванию их оперения, птицы начинают утрачивать способность держать себя на поверхности води и это ведет к их гибели [5].
Попавшая в окружающую среду нефть подвергается биодеградации при участии разных видов микроорганизмов. Показано, что активность микроорганизмов и определяет дальнейшую судьбу нефти в экосистеме. Было описано примерно 70 родов микроорганизмов и около 30 видов грибов, способных окислять углеводороды нефти. На морских побережьях, которые часто подвергаются хроническому нефтяному загрязнению, наиболее многочисленны углеводородокисляющие микроорганизмы и их численность достигают 10 % от численности всего микробиоценоза [7, 8].
Нефть в переводе с персидского языка означает восплaменяться – это горючaя, маслянистая–жидкость, имеющая специфический запах светло-коричневого (бесцветного) или темно-бурого цвета [6].
Ссылаясь на государственный стандарт РФ Р 51858-2002, дают 2 определения–нефти:
1. Сырая нефть – это жидкая природного происхождения углеводородная–смесь, которая содержит не только воду, но и минеральные–соли, механические–примеси, растворенный–газ. Такая нефть является одним из наиболее–важных компонентов для производства как энергоносителей в жидкой форме так и битума, смазочных–масел и кокса [6].
2. Товарная–нефть – это нефть, которая перед тем как отправиться до конечного потребителя подвергается дополнительным манипуляциям и которая полностью соответствует всем характеристикам принятых в установленном–порядке и действующих в настоящее время технических и нормативных–документов [6].
Если посмотреть с точки зрения научной химии, то нефть – это сложная–смесь органических соединений, основу которой составляют углеводороды различного строения. При этом необходимо иметь в виду, что нефть, полученная из различных–месторождений, может отличатся друг от друга как по своему строению так и по составной части. Вследствие этого практически нет возможности дать общую характеристику этому продукту [7].
Основными характеристиками нефти и нефтепродуктов являются:
1) вязкость;
2) температуры вспышки, воспламенения и самовоспламенения;
3) плотность;
4) молекулярная масса (вес);
5) оптические свойства;
6) растворимость и растворяющая способность;
7) температура помутнения, застывания и начала кристаллизации;
8) электрические или диэлектрические свойства.
Плотность–нефтепродуктов и нефти. По причине того, что нефть имеет углеводородный состав, ее показатель плотности определятся меньше единицы. Показатели плотности нефтепродуктов главным образом имеют зависимость от фракционного–состава и могут изменяются в пределах, представленных в таблице 1.
Таблица 1 – Пределы изменения показателей плотности нефтепродуктов в зависимости от фракционного состава
№ п/п Наименование нефтепродукта Плотность, г/см3
1 Нефть 0.800-0.950
2 Бензин 0.710-0.750
3 Керосин 0.750-0.780
4 Дизельное топливо 0.800-0.850
5 Масляные погоны 0.910-0.980
6 Мазут 0.950
7 Гудрон 0.990-1.0
8 Смолы > 1.0
Плотностью называют это массу вещества, которая заключена в одной объемной единице. И размерность этой–величины измеряется кг/м3 или г/см3 [8].
В целях дать точную характеристику нефти, в большинстве случаев, используют величину относительной плотности. Это безразмерная величина, которая оказывается равна отношению массы–нефтепродукта к массе дистиллированной–воды, взятых в одинаковых объемах в условиях 40С:
t4=mнt(mвt), (1)
где:  - относительная–плотность, mнt- масса–нефтепродукта, mвt - масса дистиллированной–воды.
Так как в условиях 40С показатель плотности воды равен единице, то значения относительной и абсолютной плотности в числовом эквиваленте практически совпадают. Плотность–нефти определяют при температуре 15-200 С [9].
Данная зависимость показателя плотности нефтепродуктов от температурного значения носит линейный характер. Если принимать во внимание знание значения плотности нефти при данной–температуре t градусов, то имеется возможность найти и ее–плотность при 200 С:
204= t4 + t *( t - 20), (2)
где: t – температурная поправка к плотности на 1˚С, является константой или может быть найдена по–формуле:
t= (18,310 – 13,233*204)*10-4, (3)
В некоторых случаях эту формулу изменяют и называют формулой Д.И.Менделеева:
t4=204- t *( t - 20), (4)
В конечном итоге, плотность нефти и нефтепродуктов численно уменьшается с ростом температуры [10].
Показатель плотности нефти оказывается меньше–единицы и находится в–пределах 0,80-0,90. Смолистые высоковязкие–нефти имеют плотность близкую к значению–единицы. Существенное–влияние на величину плотности– нефти оказывают растворенные–газы смолистые вещества, находящиеся в ней, и так же ее фракционный– состав [11].
Молекулярная масса (молекулярный–вес) нефтепродуктов и нефти имеет близкое к среднему значение и в большинстве случаев зависит от количественного–соотношения компонентов–смеси.
Первым–представителем из многочичленных жидких углеводородов в составе–нефти является пентан. Его молекулярная–масса равна 72 у.е [7]. Это значение у смолистых–веществ–достигает величины от 1.5 до 2.0 тыс. у.е. Средняя же молекулярная–масса для нефти–находится в границах от 250 до 300 у.е. При чем при увеличении диапазона кипения нефтяных–фракций наблюдается постепенное увеличение и молекулярной–массы (Мср.) от 90 (для фракции 50-1000С) до 480 (для 550-6000С) [9].
Для осуществления технологического расчета существует формула–Войнова [10]:
Мср.=а+b + ct2cр. (tср. – средняя температура кипения), (5)
Для алканов эта формула имеет вид:
Мср.=60 + 0,3 tср. + 0,001 t2cр. , (6)
За пределами РФ для более полной характеристики молекулярной массы нефтепродуктов и нефти используют формулу–Крега, в которой используется показатель плотности в условиях при150С [10]:
Мср.=44,29*15/(1,03- 15), (7)
Для большей точности для определения средней величины молекулярного веса нефтепродуктов пользуются данными из экспериментального исследования, полученными эбулеоскопическим и криоскопическим–методами [12].
Вязкость (или внутреннее–трение) нефтепродуктов и нефти во–многом зависит от фракционного и химического–состава. Различают 2 типа вязкости: кинематическую ()и динамическую (ή).
1. Вязкость динамическая (ή) или внутреннее трение – это свойство некоторых–жидкостей, которое заключается в появлении сопротивления к касательным сдвигающим–усилиям. Это свойственная характеристика может провялятся только в случаях движения–жидкостей. Единицей–измерения здесь принято считать – н*с/м2. Вязкость–динамическая иногда может характеризоваться как–сопротивление, которое проявляет жидкость при перемещении двух–слоев [13].
2. Вязкость–кинематическая– это величина, численно–равная отношению вязкости–динамической к ее показателю плотности при данной оптимальной температуре [13].
Определение значения кинематической вязкости осуществляют в приборах – стеклянных вискозиметра, оборудованных–калиброванными капиллярами [12].
Для фракций нефти с возрастанием их молекулярного веса существенно увеличиваются значения температуры–кипения и вязкость. К примеру, вязкость бензинов при 200С имеет–значение 0.6 сст, а вязкость остаточных–масел 300-400 сст [13].
Значение показателя величины–вязкости полностью зависит от значения–температуры. В условиях пониженной температуры показатель вязкости некоторых нефтепродуктов существенно может увеличиваться и наоборот. По причине того, что большинство масел и некоторых других нефтепродуктов может применяться в достаточно широком пределе температурных границ, то обычно–характер кривой–температур вязкости является для них главной–качественной характеристикой. Чем эта зависимость более–прямая, тем качество масла будет выше [14].
Эмпирическая формула–Вальтера описывает зависимость–вязкости от температуры [10]:
lg[lg(t+0.6)]= A – B lgT, (8)
где: А и В - постоянные величины.
Для того, чтобы оценить вязкостно-температурные свойства нефтяных–масел используют на практике следующие–показатели: показатели:
Отношение вязкости при 500С к вязкости при 1000С (50/100);
Температурный–коэффициент вязкости (ТКВ), определяемый в диапазоне от 0 до 1000 С и от 20 до 1000 С по приведенным ниже формулам:
ТКВ0-100=(0-100)/50иТКВ20-100=1.25(20 - 100)/ 50, (9);
3) Индекс–вязкости является условно-принятым показателем, который дает сравнительное описание эталонного и–экспериментального масла. -
Температуры-вспышки, воспламенения и-самовоспламенения. Температура-вспышки - это температура, при которой пары, исходящие от нагретого в определенных-условиях нефтепродукта, начинают образовывать с воздухом атмосферы смесь, характеризующуюся взрывоопасностью и воспламенением при приближении к ней-огня. Значение этой температуры прямым образом зависит от-состава нефтяных-фракций [7]. При этом усредненное значение температуры-воспламенения бензинов находится в пределе от 30 до 400С, керосинов 30- 600С, дизельных топлив 30-900С и нефтяных-масел 130-3200С [14].
Температура-воспламенения – это температура, при которой нагреваемый-нефтепродукт отличается свойством воспламеняться условиях присутствия открытого источника огня и таким образом гореть в течение 5 секунд. Эта-температура обычно выше значения-температуры вспышки[11].
Температура-самовоспламенения – это температура, при которой нагреваемый-нефтепродукт, находясь в-контакте с атмосферным-воздухом, начинает произвольно-воспламеняется без присутствия открытого огня. Данная температура зависит от состава-фракций, значение величины ее падает-с возрастанием среднего-молекулярного веса нефтепродукта [7].
Температуры-помутнения, застывания и начала-образования кристаллов. Нефть не обладает четкой-температуры для перехода в разные агрегатные-состояния, по причине того, что она не являются индивидуальным-веществом, а представляет собой комплекс-соединений органики.
Низкотемпературные-свойства нефтепродуктов имеют-характеристику температуры-застывания. Некоторые топлива характеризуют значением температуры-помутнения. Ароматические-углеводороды в составе карбюраторного и реактивного-топлива, позволяют охарактеризовать их температурой-начала образования-кристаллов [14].
Температура-застывания проявляется в потере-текучих-свойств нефтепродуктов в низкотемпературных-пределах. Возрастание концентрации парафинов в составе нефтепродукта может привести к увеличению температуры его застывания [7]. Здесь имеет необходимость указать, что потеря текучих-свойств так же может-быть связана и с повышением величины-вязкости нефтепродукта и со снижением-температуры [14].
Температура-помутнения влияет на способность-топлива поглощать в пределах пониженных температур влагу из атмосферного-воздуха.
Температура-начала кристаллообразования карбюраторных и реактивных-топлив не должна быть выше значения в 600С. Именно по этой причине в зимних видах-бензина недопустимо присутствие-повышенного содержания ароматических-углеводородов. При увеличении их присутствия в составе нефтепродукта, они могут-выпадать в осадок в виде-кристаллов, и это может-привести к засору-фильтров и к остановке в работе-двигателя [7].
Электрические - (диэлектрические) свойства-нефти. Безводные-нефтепродукты являются по своей сути-диэлектриками. Достаточно высокие их диэлектрические-свойства благотворно влияют на-накопление на их поверхности статического-электричества. Его разряд в конечном итоге может вызвать искрообразование, что далее приведет к загорание-нефти. Наилучшим способом в-борьбе с запасанием статического-электричества служит заземление-всех составных компонентов-аппаратуры из металла. [15].
Оптические-свойства нефти. Среди таких характеристик выделяют цвет, флуоресцентную и оптическую активности.
Углеводороды-нефти в большинстве случаев цвета-не имеют. Разнообразный-цвет дают нефти вещества, содержащиеся в ней, такие, как смолы, асфальтены-и некоторые сернистые-соединения. Чем тяжесть нефти выше, тем цвет ее более темный [7].
Флуоресценцией-называется свечение в отраженном-свете. Это свойство является-характерным только для сырой нефти. Иногда его связывают с присутствием-в нефти ароматических полиядерных углеводородов [8].
Оптическая-активность нефти указывает-на ее-способность к вращению-плоскости поляризации-света. На практике это определение не нашло широкого применения [8].
В целях описания количественной характеристики оптических-свойств нефти обычно пользуются-показателем преломления (n20D), удельной-рефракцией (r), рефрактометрической-разностью (Ri), удельной-дисперсией ().
Растворимость и растворяющая-способность нефти. Нефть обладает способностью-хорошо растворять различные-соединения такие, как йод, сера, сернистые-соединения, различные-смолы, жиры [13]. Это исследуемое свойство приобрело достаточно широкое практическое использование в технике. Таким образом, на основе нефтепродуктов изготавливают большинство хороших и качественных-растворителей для различных отраслевых-промышленностей. Среди газов хорошо-растворимых в нефти выделяют воздух, оксид и диоксид-углерода, сероводород и т.п. В условиях водной среды ни нефть, ни углеводороды не-растворяются [16, 17].
1.1.2 Нефтяные загрязнения и их последствия
Нефть, как известно, это продукт, имеющий природное происхождение. Она проникает в биосферу исключительно только естественным-путем. На данный момент времени такой продукт как товарная нефть выходит-широко за пределы своей-добычи благодаря перевозкам в цистернах и-танкерах, перекачкам по нефтетрубопроводу, а в конце пути начинается ее окончательная переработка в топливо и на-нефтепродукты [6]. Любой процесс сопровождается образованием отходов, которые могут попадать в условия окружающей среды. По причине этого мировой океан стал самой обширной «сточной-канавой» ведь все загрязняющие-вещества планеты рано или поздно вливаются в морскую-воду, а это в свою-очередь может нанести огромный-вред морским-обитателям, а потом и -человеку [18].
Существует большая вероятность того, что если загрязнение морей не прекратится к окончанию XXI в, то все живые существа в океане исчезнут. Особой-опасности подвергается Средиземное-море, где сильнее всего страдают-от загрязнений широкие-зоны побережий Франции и-Италии. Купание здесь на многих пляжах практически находится под запретом, так как загрязненная морская-вода может привести к появлению-тяжелых заболеваний [19,20].
Самоактивация процесса очищения у берегов-стран - ФРГ, Нидерландов, Бельгии, Франции, Англии, Норвегии и Дании Северного-моря - до настоящего-времени очень-переоценивалась. Среднее значение-глубины моря у берегов (шельф) приблизительно равно 80 м, на Доггер-Банке - 20 м, и, сравнивая с-Атлантикой (средняя глубина 3500 м), оно является «чайным блюдцем». Реки, которые-впадают в воды Северного-моря, Рейн, Везер, Эльба, Темза, уже давно являются загрязненными. Даже соленая-вода океана не может справиться с этим. Но в условиях Северного моря приливы и отливы гораздо-сильнее, чем, в Балтийском-море, но они все же не могут привести к полной-замене водной-толщи. В таких условиях не помогают даже и штормовые-волны - вода-колеблется, но не-перемешивается. Так же Северное-море сплошь усеяно буровыми-вышками для нефтедобычи и добычи-газа, по нему плавают большие-количества нефтяных-судов, перевозящих ядовитые-вещества, и поэтому по факту химического-загрязнения с ним не может-сравниться ни одно другое-море [19].
Международный совет экспертов по вопросам окружающей среды в 90-е гг. прошлого-столетия опубликовал полный-отчет по состоянию Северного-моря, и предостерегал, что «нефтяная чума» в скором времени может захватить и всё море, которое и так находится под серьезной угрозой. Но специалисты не способны дать заключения о всех масштабах, причинах и последствиях-данных загрязнений в этом-море. Эксперты в своем-заявлении основываются на разных экспериментальных-оценках и теоретических расчетах. Однако, нет крупномасштабных межгосударственных-программ по измерению загрязняющих-компонентов в этом море [19].
К большому несчастью, влияние на флору и фауну морей вредных ядохимикатов изучено в настоящее время слабо, и так же нет данных о взаимодействии их друг с другом[20]. В условия окружающей среды ежегодно проникает порядка 40 тыс. химикатов различной природы, и всё это носит антропогенный характер [21].
Пока не началась-катастрофа и опасное нарушение-экологического состояния планеты, люди не ощущают на себе-давления, которое может привести к срочному-принятию мер по экобезопасности. Но когда такие загрязнения морей окажутся явными, это может быть уже-поздно. Наносимый таким образом вред природе к тому-времени может стать уже абсолютно необратимым.
Процессы добычи, морской и сухопутной транспортировки нефти и дальнейшее ее переработка и использование - все это является большой опасностью для Мирового-океана. К 1980 г. во всем мире существовало порядка 4 тыс. танкеров, осуществляющих морскую-перевозку 1700 млн. т нефти (это около 60 % всего потребления-нефти в мире). Примерно 450 млн. т сырой-нефти (это 15 % годовой-добычи в мире) изымалось-из месторождений, которые находились на дне-моря. Национальная академия наук США оценила масштабы загрязнения, выяснилось, что из всего добывающегося объема нефти в моря попало свыше 1,6 млн. т, это составляет 26 % [19].
Оставшаяся часть нефти (около 3/4) попадает в море с судов-сухогрузов вместе с лояльными-водами. Помимо этого так же остатки горюче-смазочных-материалов, которые сбрасываются в воду по-случайной или намеренной-причине с промышленных-предприятий, расположенных непосредственно на самом побережье или по берегам-рек, несущих свои воды в море, а так же с нефтепромысловых-станций и нефтехранилищ [6].
На суше складывается точно такая же картина. При проникновении вязкой нефти на почву она просачивается в грунтовые подземные воды, там она переносится по направлению их течения и, таким образом, может распространяться на очень большие территории. Нефть по своей природе гидрофобна, и на поверхности воды она может образовывать тонкую пленку, и впоследствии такая воду уже становится непригодной для потребления в расчете 1 л нефти на 100 л воды [22,20]. Нефть в комплексе с-водой так же может образовывать эмульсионный слой на открытой водной поверхности с, который в свою очередь способен препятствовать газообмену-с воздухом, что в дальнейшем может привести к гибели-всех живых организмов под пленкой. Морские птицы контактируют с нефтью и ведет к склеиванию их оперения, птицы начинают утрачивать способность держать себя на поверхности води и это ведет к их гибели [20].
Попавшая в окружающую среду нефть подвергается биодеградации при участии разных видов микроорганизмов, но этот-процесс идет медленно. За этот период ее легколетучие компоненты подвергаются испарению, а оставшиеся часть медленно окисляется [21, 23].
Любая-экосистема обладает способностью-к самоочищению, и эта способность зависит-от ряда факторов – биологических, физических, биохимических, физико-химических. Нужно отметить и гидродинамические факторы, они первоначальными факторами-самоочищения не являются, но могут либо ускорить, либо оказывать ингибирующее действие весь процесс самоочищения. В конечном итоге наиболее важным-фактором в данном процессе самоочищения природной-среды от нефтезагрязнений является жизнедеятельность микроорганизмов-биодеструкторов [21, 24].
Деградации-нефти – это главный механизм самоочищения воды от органических веществ. В этом случае биохимические воздействия наиболее ярко-выражены. Испарение в свою очередь занимает первое место в процессе разрушения пятен нефти. Углеводороды с длинными цепочками до С15 и с температурой кипения до 250 °С испаряются с поверхности-воды за 10 суток, углеводороды с С15 до С25 (250-400°С) сохраняются дольше, а более тяжелые фракции с С25 и далее практически не подвергаются испарению. Итак, только с помощью одного испарения можно удалить до 50 % сырой нефти, до 10 % тяжелой и до 75 % топливной нефти [25].
Проводимые в Каспийском море экспериментальные исследования показали, что часть нефтяных загрязнений способна деградировать при автокаталитическом окислении по цепной реакции свободных радикалов с образованием гидроперекисей, а продукты разрушения последних являются активаторами окисления углеводородов [26].
Показано, что активность микроорганизмов и определяет дальнейшую судьбу нефти в экосистеме. Было описано-примерно 70 родов микроорганизмов и около 30-видов грибов, способных окислять углеводороды нефти. На морских побережьях, которые часто подвергаются хроническому нефтяному загрязнению, наиболее многочисленны углеводородокисляющие микроорганизмы и их численность достигают 10 % от численности всего микробиоценоза. В первую очередь микроорганизмы начинают использовать n-алканы, и это ведет к повышению содержания ароматических соединений и алканов с разветвленной цепью. Затем потреблению подвергаются и ароматические соединения. В процессе деградации нефти в окружающей среде начинают накапливаться различные продукты неполного окисления углеводородов, являющиеся субстратом для микроорганизмов. Это спирты RОН, кетоны RСОR, фенолы-С6Н5ОН, гидроперекиси RООН, альдегиды RCНО, пигменты, сахара, органические кислоты, полисахариды, аминокислоты, липиды. Сложный состав нефти во многом требует и разнообразие микрофлоры, способной использовать помимо компонентов нефти и продукты своего-метаболизма. Поэтому сырая нефть эффективнее разрушается смешанным микробиоценозом, а не отдельными штаммами бактерий [21, 27, 28].
Микробное окисление углеводородов нефти ускоряется и замедляется при- воздействии разных природных факторов. Ускоренное окисление нефти происходит в хорошо насыщенном кислородом субстрате. Для полного окисления-1 л нефти необходимо 3300-г О2. На этот процесс оказывает влияние соленость воды (при повышении солености на 1 % период полураспада-нефти удлиняется на 24 часа), рН- (при повышении рН на 1 период полураспада снижается в среднем на 24 часа). В результате всех исследований, было показано, что доля деградации углеводородов нефти с помощью микроорганизмов составляет примерно 50-60 % [26-27, 29].
Проводимые в данной области исследования показали, что нефть при попадании в морскую воду, не вызывает сильной опасности для водных организмов и не способна накапливается в них, и маловероятно ее попадание в организм-человека по пищевой цепочке [20]. Наибольшую опасность представляют нефтепродукты – это-бензин, дизельное топливо и высокие фракции-нефти на приливно-отливной зоне. Здесь концентрации-нефти долго остаются высокими и наносят вред, однако, это достаточно редкое явления, так как во время катастроф нефть растекается по воде и разбавляется и потом начинается ее окисление [30].
Во время разлива-нефти нужно принимать быстрые меры по борьбе с загрязнением. Важно-эффективно руководить всеми-операциями по борьбе с бедствием, так же на конечный результат влияют и географические и метеорологические условия непосредственно на самом месте катастрофы. Груз нефти из пострадавшего-танкера перекачивают на другое судно для того, чтобы предотвратить или снизить вероятность-загрязнение морской воды. При легком штиле и слабом волнении моря потерпевший аварию танкер окружают плавающими, надутыми воздухом шлангами - бонами, препятствующими дальнейшему распространению пятна нефти, что в итоге позволит вычерпать или собрать с-помощью насосов разлившуюся нефть. В настоящее-время существует множество технических систем, предназначенных для сбора пролившейся нефти, но большинство из них может работать лишь при сравнительно-спокойном море [31, 32].
Разные фирмы и предприятия на территории различных стран мира сконструировали системы, применять которые возможно и во время шторма. Эти механические системы работают с-помощью химических средств -диспергаторов. Эти вещества увеличивают влияние волн и ветра на нефтяной слой, разбивая сплошной слой на более мелкие по размерам капли, исчезающие в дальнейшем-с водной поверхности. Так же диспергаторы способствуют ускорению биодеградации нефти, та как мелкие капли служат для бактерий местом для колонизации. Существуют попытки сжигания разлившейся нефти или засыпания ее песком или известью, -которые захватывают ее и погружаются в комплексе с ней на морское дно, но пока положительный результат этих методов ограничен [24, 31, 32].
Примерно 25 % сырой-нефти выливается в океан с танкеров и буровых установок, и только седьмая часть от этого объема попадает в результате аварий. Для обеспечения безопасности опустошенные танки во время порожнего рейса для балласта заполняют морской водой. Затем смесь воды с нефтью откачивают в специально предназначенный -для этих целей танкер, там отделяется нефть, а ставшую почти чистой воду сбрасывают в море, нефть, оставшаяся в танке, в дальнейшем смешивают с новым объемом нефти. Такая система нашла повсеместное применение. Существуют данные в пользу этой системы: танкеры, на которых она используется (80 %), сливают ежегодно в море всего 300 тыс. т нефти, а остальные, где эта система отсутствует - в 3 раза больше (800 тыс. т). Таким-образом, в борьбе за чистоту планеты еще сохраняются резервы, и чем быстрее они будут использованы, тем станет лучше для нашей планеты [29, 32].
Совершенствованием конструкций-цистерн и танкеров, двигательных установок, управления приборами навигации, можно достичь снижения нефтяных загрязнений, как на суше, так и на море [31].
1.2 Основные методы ликвидации нефтяных загрязнений
Нефть и нефтепродукты просачиваются в природную среду вместе с отходами, например, в процессе бурения в ходе строительства скважин, а тек же во время хранения в амбарах и при крупных авариях на нефтепроводах.
В сточных-буровых водах нефть и нефтепродукты могут присутствовать как в виде пленок, так и эмульсий. Основные методы ликвидации разных видов разлитой нефти не являются одинаковыми и предполагают связанные-с этим некоторые трудности. Наиболее сложной представляется операция по удалению эмульгированной нефти, которая образуется при механических и гидродинамических воздействиях во время перекачки сточных вод, загрязненных нефтепродуктами, по трубопроводам с помощью насосных агрегатов. Такие эмульсии обладают дисперсностью, она определяется диаметром возникающих капель и удельной межфазной поверхностью, а также устойчивостью, зависящей от дисперсности системы, физических и химических свойств эмульгаторов, которые образуют адсорбционные защитные пленки на границе раздела фаз [25].
Для удаления с водной поверхности нефтяной пленки нужно пользоваться специальными устройствами и сорбентами. Но в этом случае степень окончательной очистки не будет до конца достигнута.
Механическое удаление нефти. В настоящий момент времени существует большое количество разнообразных способов и методов сборки нефтяного пятна с водной поверхности, это, например, ручное вычерпывание и использование машин-нефтемусоросборщиков. Предварительным этапом в таком случае является концентрирование и ограждение находящейся на поверхности воды разлитой нефти с помощью конструкций - плавающих бонов. В состав конструкции такого сооружения 3 основные части: плавучие, экранирующие и балластные. Плавучая часть бона может быть как в виде отдельных поплавков прямоугольных или круглых в сечении. Экранирующая часть имеет вид гибкой или жесткой пластины, присоединенной к плавучей части бона и нагруженной цепью для балласта, чтобы придать устойчивость [33].
Примером заграждения подводного типа можно считать пневматический барьер. Основной принцип работы устройства такого типа заключается в том, чтобы создать на поверхности водной среды препятствие при непрерывном потоке воздуха через находящуюся на дне водоема перфорированную трубу [34].
В борьбе с ликвидацией нефтяного пятна необходимо оборудование, которое может эффективно работать в разнообразных климатических условиях, даже в присутствии плавающего льда и мусора. Так Канадская нефтяная ассоциация (КНА) идее Общество, которые занимаются борьбой такого рода, как самостоятельно так и совместно со службой охраны окружающей среды проводили исследования по разработке устройств с дивертором пузырьков воздуха, способствующих сбору нефтяного загрязнения, в том исключительном случае когда насосы и скорость течения воды могут препятствовать использованию плавучих бонов [35]. Основу дивертора составляют отрезки труб перфорированных шлангов. Сжатый воздух в нем подается через перфорации из компрессора, находящегося на берегу. Благодаря такому-расположению дивертора, нефть под утлом направляется к берегу и уже на берегу собирается с-помощью ковша.
На территории Франции для того чтобы очистить водную поверхность от нефтезагрязнений были разработаны и до настоящего времени находятся в эксплуатации специальные устройства под названием «Циклон», которые устанавливаются в бортовой части судна [34]. Они во время движения собираютри сепарируют загрязненную воду.
Во VNIISPT нефти был сконструирован и испытан опытный экспериментальный образец устройства, предназначенного для собирания нефти с поверхности водной среды в случае аварий на нефтепроводах, находящихся на дне судоходных рек [35]. Создание вихревого эффекта – это основной принцип работы этих. Устройство сборщика нефти включает заборный элемент, вспомогательные оборудования - мостик, секции для перехода, две секции для соединения, заборщик мусора; ограждение из бона, которое состоит из оградительных и якорных секций, сам сборщик, пульт для управления передвижной электростанции. Проведенные испытания дали результат, при этом эффективность положительной работы сборщика нефти напрямую имеет зависимость от размера плавающего нефтяного пятна (толщины )и при толщинер3,5 ммровнар30 м3/ч [35].
Так же для собирания нефти с водной поверхности были сконструированы безнапорные гидроциклоны, которые представляют собой корпус цилиндроконической формы, имеющий одни или несколько входных каналов, расположенных в цилиндрической части. Нижняя часть корпуса имеет тангенциально расположенный патрубок для отвода воды; внутри конусной части – патрубок для отвода собранных нефтепродуктов. Безнапорные гидроциклоны, имеющие несколько входных каналов, обычно используют для сбора нефтепродуктов с неподвижной водной поверхности [36, 37]. В проводимых исследованиях безнапорный гидроциклон устанавливался перед нефтесборной трубой в одну из песколовок таким образом, что канал для входа был расположен навстречу потоку сточной воды. При этом глубина, на которую погружали аппарат, регулировали по ходу заполнения нефтяных "карманов" водой. После начала работы насосов вода с поверхностным нефтяным слоем направляется в аппарат. В дальнейшем слой нефти начинает вращаться по кругу и скапливаться в центральной части рабочего объема аппарата, откуда потом и откачивается по патрубку для нефтеслива. Эффективность работы гидроциклонов во многом определяется их размещением на обрабатываемой территории [36, 37].
К группе механических способов относят так же фильтрование загрязненной воды. Самым простым механизмом является фильтр из песка, с использованием кварцевого песка крупностью частичек 0,5 - 2,0 мм с высотой слоя до 1 м. Здесь возможно допущение использования дробленого антрацита, керамзита и керамической крошки [38]. Процесс фильтрации идет сверху вниз со скоростью от 5 до 10пм/ч, при этом остаточная концентрация нефтепродуктов в очищенной воде составляет от 10 до 20ммг/л, при начальном ее содержании от 40 до 80имг/л [39].
Физико-химические методы утилизации нефти. Сюда относят использование материалов адсорбентов - пенополиуретан, угольная пыль, резиновая крошка, древесные опилки, пемза и т.п. так же возможно использование различных сортов соломы, адсорбирующей нефть. Возможно использование губчатого материала из полиуретана, который достаточно эффективно впитывает нефть и продолжает находиться на плаву после адсорбции [40]. Исходя из полученных данных, 1 м3 полиуретанового открытопористого пенопласта способен к сорбции с водной поверхности примерно 700 кг нефти.
В процессе сборки и нейтрализации нефтяного разлива с помощью адсорбентов, которые распыляют на нефтяную пленку в виде порошка, часто прибегают к применению материалов органического и неорганического происхождения, которые предварительно обрабатывают гидрофобизаторами такими, как вспученный перлит, вермикулит, пемза, вспененные полистирольные гранулы, стружка фенольного пенопласта.-
Наиболее эффективным сорбентом здесь являются полиуретановые гранулы-пенопласта. Они способны адсорбировать нефть в количествах, в 20 раз превосходящих собственный вес. Применяют также материалы, изготавливаемые из ацетата Na, смеси полиэтилена и парафина, древесные опилки и т.д. Но все эти вещества на много уступают пластмассовым микробаллонам (пламилону), которые поглощают объемы нефти, в 40 раз превышающее их собственный вес [35].
Перспективным является использование гранулированных адсорбентов и жидкостей, которые обладают магнитными свойствами и после процесса адсорбции нефть можно легко удалить при помощи-магнита. Американской фирмой "Amco Systems" была разработана технология использования для сборанефти магнитной жидкости - "магнекола", которая придавала нефтисвойства магнита и позволяла удалять ее даже в виде тонких пленок. Но применение этих материалов не решает проблемы, так как перечисленные реагенты являются токсичными. Кроме этого существуют трудности с более или менее равномерным распределением гранул адсорбента на поверхности воды с-загрязнителем, особенно в ветреную погоду [34].
Для утилизации-нефти можно использовать и минеральное сырьё, в частности перлитовое. В условиях термообработки-при 600 - 1000°С перлитовое сырьё начинает вспучиваться. В дальнейшем, путем обработки для гидрофобизации вспученного перлита, на его поверхность наносят парафинополимерную смесь и парафиностеариновую эмульсию в виде тонкой пленки. Поглощение нефти в итоге увеличивается от 0,52 до 0,70 г/г перлита. Подвергнутый обработке перлит, попадая на поверхность воды, адсорбирует собой загрязнитель и образует густую и плотную массу, удобную для последующего сбора обычными средствами.
При применении микробаллонов пластмасс (пламилона) значительно снижается и расход самого адсорбента. В целях сборки 1 т нефти нужно 40-130п кг пламилона [41]. Уровень очистки таким образом достигает отметки в 97 %.
В качестве адсорбента применяют эластичные и волокнистые материалы. К примеру, растительного происхождения волокнистые адсорбенты имеет сорбционную емкость 30 г/г адсорбента. Эластичные адсорбенты такие как, каучук из изопрена имеет емкость 17 г/г адсорбента. Так же широко известны и модифицированные волокнистые адсорбенты VBM, VT и VTM [42]. Сорбционное равновесие здесь достигается в течением5имин. Изменение температур, происходящее в диапазоне от 2 до 25°С, практически не оказывает влияния на величину адсорбции. Максимальный уровень адсорбции VBM, VT и VTM составлял 37, 41 и 50 г/г адсорбента соответственно.
Напорная флотация и флотация с помощью механического диспергирования воздуха все больше применяется в очистительных процессах нефтесодержащих сточных вод. Исследования работы напорных установок флотации показывали, что увеличения эффективности доочистки можно достичь путем увеличения эффективности процесса предварительной обработки сточной воды при помощи реагентов. Это позволит снизить уровень загрязнения нефтепродуктами.
Если концентрация нефтепродуктов в воде мала, то наиболее эффективно будет использование активированных углей. Кроме того на эффективную работу адсорбции влияют состав сточной воды, свойства примесей, содержащихся в ей, температурный режим, рН [43]. Угли активированные, применяемые для очистки сточных вод, содержащих кроме нефтепродуктов и другие соединения с высокой молекулярной массой, должны обладать относительной крупнопористостью для того, чтобы их поверхность была доступной для сложных веществ; обладать малой удерживающей способностью во время регенерации и увеличенной способностью к истиранию, также легко смачиваться водой [43]. В России извлечения нефтепродуктов адсорбционным методом используют пять наиболее известных марок промышленно изготавливаемых углей:иАГ-3,иКАД-йодные, БАУ, ДАК,ъАГ-5 [44].
Химические методы удаления разливов нефти. Нефть удаляют при помощи химических соединений – детергентов. К этим веществам относят разные растворители и вещества, которые образуют эмульсию, химически воздействующую на молекулы соединений углеводорода и изменяющие их поверхностное натяжение. Наибольшее число этих соединений относится к алкилбензолсульфонатам натрия, отличающихся по длине углеродной цепи, связанной с бензольным кольцом. Необходимо отметить, что детергенты более токсичны для морских организмов, чем сама нефть[45].
Разработаны аналитической лабораторией Института океанологии АН СССР средства ЭПН-5ви ДН-75ви методы их применения, которые прошли экспериментальную проверку и доказали свою эффективность [46]. Для достижения этой цели была предложена [47] новая модификация использования торфа, которая заключается в использовании капроновых пористых бон, заполненных термически обработанным торфяным порошком. Этот метод в значительной степени упрощает механизм сбора и удаления нефтепродуктов с водной поверхности.
Для более эффективной очистки водной поверхности от нефти также предлагают использовать состав, который содержит ферромагнитный материал и кремнийорганическое соединение (железосодержащая окалина 99,50- 99,95 % и метилсиликонат натрия 0,05-0,5 %) и состав, содержащий комплекс ПАВ и носитель, в качестве которых используют мылонафт - 65-95% и нафтеновые кислоты -а5-35%.
Исследователь Р.А. Дашдиев вместе с соавторами предлагает способ удаления тонкой нефтяной пленки с водной поверхности, заключающийся в нанесении на поверхность пленки пропитанного ПАВ сорбента и в последующем сборе отсорбированной нефти. В качестве сорбента можно использовать полипропиленовое волокно, а в качестве ПАВ - неонолаП1013/3 или оксанол аЦО – 3 [48].
Существует и много других материалов, используемых в качестве сорбентов для сбора нефти с водной поверхности. Это говорит о широком распространении в мировой практике химического метода [48, 49].
Биологическое разложение нефти. Наиболее перспективным направлением в данной области является разрушение нефти микроорганизмами. Нефть для определенных видов бактерий служит питательной средой. Но естественная скорость микробиологического разрушения нефти в воде не велика, и, следовательно, этот процесс требует большого количества времени. Было определенно, что биологическая активность наибольшим образом зависит от температуры; скорость микробиологических процессов повышается при каждом последующем увеличении температуры на п10°С. На процессе развития микроорганизмов сказывается влияние содержания высоколетучих компонентов нефти. При внесении в воду небольшого объема нитрата и фосфата (0,1 и 0,35 гена 100емл соответственно) повышает степень разложения нефти нар70%.
Общее число соединений органики, используемое микроорганизмами-гетеротрофами в качестве источника углерода, очень велико. Существует предположение, что для каждого углеродного соединения, образуемого в природе, существуют микроорганизмы, способствующие их разложению.
Поглощение микроорганизмами углеводородов нефти является установленным фактом, но многие вопросы, связанные с микробиологической трансформацией нефти, изучены плохо. Присутствие нефти в экосистемах является важным экологическим фактором, обусловливающим развитие определенных видов микроорганизмов, способных использовать составные компоненты нефти в качестве единственного источника углерода и энергии. Оценка степени загрязненности почв и методы их очистки разработаны гораздо слабее, чем для воды. Но именно почва служит резервуаром, где идет накопление загрязнений в больших объемах. В связи с этим изучение влияния нефти на биологические процессы, которые происходят в почве и обуславливают ее самоочищение, является важным звеном при разработке эффективных мер по охране почвенно-земельных ресурсов в стране.
Известно, что механическая очистка почв и грунтовых вод представляет собой трудоемкий процесс и связана со значительными материальными затратами. Исходя из имеющихся данных, более перспективными могут оказаться микробиологические методы, которые позволяют значительно сократить время ликвидации последствий загрязнения почвы нефтью, от нескольких десятков лет до нескольких лет и даже нескольких месяцев [50].
Химический состав нефти является одним из наиболее важных экологических факторов, которые обусловливают развитие микроорганизмов в природной среде, содержащей нефть. Наиболее доступны микробиологическому воздействию алифатические углеводороды [51]. Очистка старых нефтяных амбаров с помощью сапрофитов испытывалась на севере округа Санта-Барбара [52]. Объем амбара составила1110 м3 и в течение 6 месяцев бактерии переработалим525м3мнефти, а вся эмульсия оказалась разрушенной.
Отделом гидрологии и водных ресурсов СевНИИГИМа на Кавказе были разработаны особые рекомендации по эксплуатации биологических методов очистки поверхностных вод от нефтепродуктов. Создаются биологические системы (биологические пруды), которые обладают увеличенной способностью к самоочищению по отношению к нефтепродуктам. Такой биопруд состоит из двух каскадов плотин, выстроенных в местах сточных вод. Плотины оборудованы обычными и сифонными водосливными трубами.
Верхний каскад пруда задерживает механические примеси и более крупные частицы, которые поступают с ливневыми паводковыми водами. Вода через трубы диаметроми600 — 800 мм поступает на ложе пруда нижнего каскада, где и идет очистка воды от нефти и солей.
На плотине второго каскада биопруда водослив устроен на двух уровнях. Верхний водослив нужен для предотвращения смыва плотины стоками ливней. Нижние трубы оборудованы сифоновыми водосливами для поддержания заданного уровня в пруду. Там же установлены заглушки, которые открываются для осушения ложа пруда или аварийного спуска воды.
Вода задерживается на десятки часов для микробиологического очищения. Иловые отложения и мелководье создают благоприятные условия для роста камыша озерного, осоки, рогозы узколистной. Эти растения в значительной степени потребляют неорганические ионы и ускоряют развитие нефтеокисляющих бактерий. Многолетние лабораторные исследования подтвердили заметное снижение солевого состава вод по мере прохождения их через заросли самокрофилов. Из длительно загрязнявшейся почвы в районе скважины в Канаде были выделены микроорганизмы, использующие нефть в процессе метаболизма. Изучалась смесь мезофильных культур аэробных бактерий, представленная Pseudomonas chromobacterium и другими видами.
В лабораторных и промысловых условиях было установлено, что алканы, нафтены и ароматические вещества активно метаболизируются микроорганизмами, причем более легкие фракции указанных соединений могут полностью расщепляться. Более тяжелые, более конденсированные циклические углеводороды достаточно устойчивы к бактериальному воздействию. Неуглеводородные компоненты, в частности асфальтены, образуются как побочные продукты при разложении углеводородов, и их доля в нефти увеличивается, хотя они тоже могут подвергнуться микробиологической трансформации. Результаты данных исследований позволяют сделать следующие выводы:
Биодеградация нефти при низкой температуре происходит эффективнее при использовании микробных популяций, выделенных при той же температуре.
Микроорганизмы, выращенные из нефти определенного состава, активно метаболизируют другие типы нефти, близкие по химическому составу.
Существуют два пути ликвидации загрязнения нефтью: это удаление загрязненного слоя почвы и восстановление ее в естественных условиях. Но естественный процесс восстановления протекает довольно длительно. Это объясняется тем, что при загрязнении почв нефтью в них начинают преобладать анаэробные условия, а разложение составных компонентов нефти происходит путем окисления при обязательном участии молекулярного кислорода. Анаэробные микроорганизмы усваивают одну десятую того количества углеводородов нефти, которое способны утилизировать аэробные виды. В процессах естественного самоочищения почв большую роль играет состояние водного режима в момент загрязнения: во влажной почве нефть более устойчива к микробиологическому разложению.
Анализ полученных данных об эколого-биологических свойствах загрязненных нефтью почв показал, что для успешного решения проблемы ликвидации нефтяного загрязнения необходимы комплексные физико-химические и биологические исследования.
Биохимические принципы ликвидации углеводородных загрязнений заключаются в следующих двух подходах: активизации аборигенной микрофлоры почвы и внесении адаптированных к загрязнению штампов нефтеокисляющих микроорганизмов (биопрепаратов). Разнообразие почвенно-климатических условий (сезонные перепады температур, влажность, свойства почв), состав и свойства загрязнителя предопределяют компонентный состав микробного препарата, а также технологию его применения [52].
В последнее время предложена к использованию широкая гамма композиций на основе микроорганизмов, являющихся биопрепаратами [53]. Отечественной промышленностью освоен выпуск трех продуктов, разрешенных к использованию Минздравом и Мингеологии. К ним относятся "Путидойл" (ЗапСибНиГНИ),в"Биоприн" ("Олеворин") (ВНИИСинтезбелок, предприятие "Новые технологии") и "Деворойл" (Институт микробиологии, предприятие "Биотехинвест"). Наиболее известным зарубежным биопрепаратом является американский биопрепарат "Микробар". В товарном виде он представляет собой порошкообразное вещество, хорошо растворимое в воде.
Полученные данные свидетельствуют об эффективности метода микробиологической очистки углеводородзагрязненных почвогрунтов с использованием специальных биопрепаратов.
Серьезной проблемой защиты природной среды в нефтедобыче является ликвидация нефтяного загрязнения почвогрунтов. Скорость поступления нефтепродуктов в окружающую среду значительно превышает их разложение. Большую опасность представляет собой перенос нефти с талыми и дождевыми водами, а также способность ее к миграции в почвенном профиле. В зависимости от степени загрязнения нефтепродукты могут проникать на разную глубину, вызывая при этом изменение как верхних, так и нижних горизонтов почвы. Результатом нефтяного загрязнения почвы является битуминизация почвенного профиля, приводящая к изменению водных, воздушных, агрохимических, микробиологических и целого ряда других показателей [54].
Первоначальное, даже слабое, загрязнение почвы нефтепродуктами приводит к снижению общей численности микроорганизмов и образованию углекислого газа [55, 56]. Большинство исследователей сходятся на том, что мероприятия по восстановлению загрязненных почв должны базироваться на приемах, обеспечивающих стимуляцию естественных процессов разложения нефти.
Итак, анализ состояния проблемы свидетельствует о многообразии методов и средств ликвидации нефтяного загрязнения объектов природной среды. Их выбор должен производиться в каждом конкретном случае строго индивидуально в зависимости от природных и климатических условий.
1.2.1 Биоремедиация
На данный момент времени одним из наиболее перспективных методов в вопросе ремедиации нефтезагрязненных почв является биотехнологический подход, который основывается на применении разнообразных групп микроорганизмов-биодеструкторов, обладающих отличительной повышенной способностью к деградации нефти и нефтепродуктов [5]. Такая способность утилизировать трудноразлагаемые вещества антропогенного происхождения (ксенобиотики) -обнаружена у многих-организмов. Это свойство обеспечивается наличием у микроорганизмов специфических ферментных систем, осуществляющих катаболизм таких соединений. Так как микроорганизмы имеют сравнительно высокий потенциал к разрушению почвенных ксенобиотиков, то они способны и проявлять умение и к быстрой перестройке своего метаболизма и обмену генетическим материалом.
Понятие «биоремедиация» предполагает понимание применения устройств и технологий, которые имеют предназначение для биоочистки загрязненных почв, т.е. для ликвидации из состава почвы загрязняющих веществ [1].
 Существует два основных подхода, входящих в определение биоремедиация:
1. Биостимуляция – активизация деградирующей способности аборигенной микрофлоры внесением биогенных элементов, кислорода, различных субстратов;
2. Биодополнение – иннокуляция природных и генно-инженерных микроорганизмов-деструкторов чужеродных соединений.
Биостимуляция in situ (биостимуляция в месте загрязнения). Такой метод основывается на стимуляции роста собственных микроорганизмов экосистемы, которые обитают в нефтезагрязненной почве и которые потенциально-способны к утилизации ксенобиотика, но при этом делают это недостаточно эффективно по причине нехватки основных биогенных элементов (соединений азота, фосфора, калия-и др.) или неблагоприятных физико-химических условий. По этой причине в процессе лабораторных исследований с применением образцов нефтезагрязненной почвы есть возможность установления количественного состава питательных компонентов, необходимых микробам [5].
Биостимуляция in vitro. Отличительной характеристикой этого-подхода является то, что биостимуляция образцов естественной микрофлоры загрязненной почвы осуществляется изначально в лабораторных или промышленных условиях (в биореакторах или ферментерах). При этом обеспечивается преимущественный и избирательный рост только тех-микроорганизмов, которые имеют способность достаточно-эффективно утилизировать данный загрязнитель. «Активизированную» микрофлору вносят в загрязненный объект одновременно с необходимыми добавками, повышающими эффективность утилизации загрязнителя [5].
Существующие два пути интенсификации биодеградации загрязнителей в окружающей среде – интродукция активных штаммов и стимуляция естественной микрофлоры, они не только не противоречат, но и могут дополнять друг – друга.
Процесс загрязнение окружающей природной среды такими веществами как нефть и нефтепродукты является экологической проблемой для всего мира в целом. Именно по этой причине наиболее активно исследуются разнообразные виды микроорганизмы, участвующие в ликвидации нефтезагрязнений в природной среде [57, 58].
Сейчас наибольшее внимание уделяется выделению и изучению штаммов микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти и созданию на их основе биологически активных препаратов. Это в конечном итоге позволит в короткие сроки удалить из почвенной среды или водной поверхности попавший туда загрязнитель, превратив его таким образом в конечные продукты жизнедеятельности микробов – углекислоту и воду [59].
Основываясь на данных литературных источников можно сказать, что наибольшее распространение в нефтезагрязненных почвах получили бактерии, которые принадлежат к родам Brevibacterium, Rhodococcus, Bacillus, Acinetobacter, Arthrobacter, Micrococcus, Pseudomonas,[60-63]. В хронически загрязненных экосистемах часто встречающимися микроорганизмами безусловно являютсяа родококки. Мицелиальные грибы и дрожжи, обладающие способностью к окислению углеводородов находятся на втором месте [64].
Род Rhodococcus является представителем нокардиоформных актиномицетов [65]. Это неподвижные, неспорообразующие, аэробные грамположительные нитевидные бактерии [66]. Эти микроорганизмы живут в почвенных и водных экосистемах и классифицируются как один из большинства промышленно важных микроорганизмов. Исследования показали, что эти микроорганизмы могут расти как в мезофильных [67] так и в психрофильных [68] условиях. Доказано, что штаммы Rhodococcus содержат ферменты, с помощью которых может осуществляться биоремидиация в экосистемах. Они способны применять углеводороды нефти в качестве энергетических источников [67].  Таким образом, представители рода Rhodococcus играют важную роль в глобальной утилизации углерода.
Род Arthrobacter является представителем класса Actinobacteria. Артробактерии это почвенные бактерии, обладающие способностью к биоремедиации экосистем. Они способные не только к деградации углеводородов нефти, но так же они уменьшают количество шестивалентного хрома [69] в почве и количество вредных пистецидов, применяемых в сельском хозяйстве [70, 71].
Артробактерии являются коринеформными бактериями. Они характеризуются плеоморфизмом (непостоянство формы) и изменчивостью окраски по Граму (окрашивания положительное или отрицательное). Они имеют сложный жизненный цикл, состоящий из двух стадий. В молодой культур клетки имеют форму тонких палочек и дают отрицательную окраску по Граму. Утолщенные палочки можно наблюдать примерно через 1-2ндня культивирования. Через 30 часов клетки становятся очень короткими, имеют форму грамположительных палочек и кокков. Артробактерии являются облигатными аэробами, спор не образуют и обладают слабой подвижностью [72].
Артробактерии растут на универсальных питательных средах, с использованием различных субстратов в своем метаболизме, включая никотин, различные гербициды и пестициды, углеводороды нефти.
Из-за их повсеместное присутствие в почве и их способности метаболизировать различные вещества, артробактерии играют большую роль в восстановлении экосистем [73].
РодPseudomonas является представителем грамотрицательных аэробных гамма-протеобактерий, принадлежащих к семейству Pseudomonaceae [65]. Представители рода обладают большим метаболическим разнообразием и занимают широкий спектр экологических ниш [74].
Представители рода обладают следующие определяющие характеристики: палочкообразные, грамотрицательные, некоторые представители имеют один или несколько полярных жгутиков, аэробы, подвижные и неподвижные, неспорообразующие, каталазо- и оксидазоположительные [75].
Некоторые псевдомонады способны к усвоению химических загрязнителей из окружающей среды, и в результате они могут быть использованы для биологической очистки.  Известные разновидности подходящие для использования их в качестве биологической очистки включают:
P. аlcaligenes, участвуют в биодеграции полициклических ароматических углеводородов[76];
P. mendocina, способны деградировать толуол[77].
P. pseudoalcaligenes, используют цианид как источник азота [78].
P. resinovorans, деградируют карбазол[79].
P.veronii, участвуют в биодеграции простых ароматических органических соединений [80, 81].
Р.putida, обладают способностью разрушать органические растворители, такие как толуол[82].
P.stutzeri, способен деградировать четыреххлористый углерод [83].
Так на базе Вятского Государственного университета был выделен штамм Pseudomonas delhiensis B-11400, обладающие способностью к деградации углеводородов нефти [84]. И целью данного дипломного проекта является создание на основе данного штамма биопрепарата-нефтедеструктора для биоремедиации почв. В связи с вышесказанным целью настоящих исследований являлась отработка условий и режимов глубинного культивирования и концентрирования штамма Pseudomonas delhiensis B-11400, обеспечивающие получение биомассы, пригодной для ее использования в составе биопрепарата.
В течение последних десяти лет интерес ученых к изучению углеводородокисляющих микроорганизмов заметно возрос. Многочисленные исследования связаны с биотрансформацией, биодеградацией и биоремедиацией нефтяных углеводородов (УВ), и вопросы использования нефтедеградирующих организмов для очистки окружающей среды сегодня занимают центральное место в нефтяной микробиологии. Результатом научных трудов в этой области стали различные разработки по биоремедиации нефти, в том числе активные штаммы -нефтедеструкторы и их консорциумы, на основе которых в России и зарубежном производятся коммерческие биопрепараты для ликвидации углеводородных загрязнений. Это и "Путидойл", и "Деворойл", " Лессорб-био ", "Нафтокс" и т.д. Помимо жизнеспособных клеток микробов они содержат различные сочетания всевозможных добавок (навоз, опил, сорбент, ферменты, минеральные добавки и т.д.) [85].
Научно-исследовательские центры, занимающиеся разработкой подобных биопрепаратов, в настоящее время работают по четырем направлениям: 
1) выделение активных штаммов -биодеструкторов из аборигенной микрофлоры нефтеносных районов, сочетание нескольких штаммов в одной композиции для расширения условий применения, доказательство непатогенности подобных препаратов, - в этом направлении идет работа в России, Украине, некоторых странах ЕС (например, Чехии и Великобритании); 
2) создание препаратов на основе генетически модифицированных микроорганизмов, что позволяет расширить диапазон и, опять же, однозначно говорить о безопасности применения, пионеры в этой области США и Япония; 
3) использование вместо живых культур нефтедеструкторов их активных ферментных систем, и/или обработка загрязнений биогенными веществами (пребиотиками, биосурфактантами), активизирующими аборигенную микрофлору;
4) разработка методов комплексного биологического воздействия на нефтяные загрязнения, когда нефтесодержащий отход вначале подвергают обработке различными биологически активными веществами, упрощая и ускоряя вторую стадию, - воздействия биопрепарата, что значительно сокращает общие сроки утилизации отходов. К этому пункту можно отнести и создание многокомпонентных композиций, указанных выше: микроорганизмы, иммобилизованные на сорбенте+многочисленные пребиотические добавки, ПАВы [85].
Известен бактериальный препарат «Путидойл» [86], предназначенный для ускорения разложения нефти, в состав которого входит углеводородокисляющий штамм Pseudomonas putida. Технология приготовления биопрепарата достаточно сложна и предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий. Такой метод сушки не позволяет получить препарат с высоким титром клеток вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий перед использованием препарата применяют следующие меры: перемешивают препарат в большом количестве подогретой до 18-28°С воды, и производят аэрирование в течение длительного времени (16-24 ч). Это усложняет, а порой делает неприемлемым применение препарата в полевых условиях. Кроме того, препарат «Путидойл» оказывает угнетающее действие на естественный микробный ценоз [87].
Известен водосодержащий биопрепарат «Лессорб-био» [88], который содержит аэробные нефтеокисляющие бактерии и органический субстрат - сорбент «Лессорб» (17,5-10,5%), представляющий собой продукт обработки растительного материала (мох, древесина, торф). В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий биопрепарат содержит штаммы: Mycobacterium flavescens EX-91, Mycobacterium species ИЖ 4, Rhodococcus species 56Д, Acinetobacter species HB-1,ъподобранные в соответствии с условиями очищаемой территории. Недостатком этого препарата, как и описанного выше, является сложность состава, в том числе бактериального, а также сложность многостадийной технологии приготовления, которая предусматривает раздельное выращивание компонентов микробной массы, приготовление концентрированной клеточной суспензии, перемешивание с сорбентом и последующую сушку компонентов [88, 89].
Биопрепарат «Нафтокс» для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов [90] содержит нормальные парафины (C12-C18) - 1,0-1,5%, щавелевокислый аммоний (ЩКА) - 0,05-0,1%, воду - 98,95-98,40 и аэробные нефтеокисляющие бактерии, входящие наряду с водой в состав культуральной жидкости. В качестве бактерий в препарате использованы Mycobacterium phlei или Pseudomonas aeruginosa или Rhodococcus species. Препарат позволяет достаточно эффективно производить очистку почвы и поверхности воды от нефтяных загрязнений, имеет несложную технологию приготовления, однако, как показали испытания, имеет срок хранения не более 1 месяца [90].
Известен биопрепарат «Родер» для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов [91] на основе R-диссоциантов штаммов Rhodococcus rubber ВКМ Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1514Д, выращиваемых на средах с высоким содержанием морской соли. Данный биопрепарат содержит в консорциуме штаммов только прокариотических микроорганизмы (бактерии), что сужает возможности при очистке окружающей среды от углеводородов [91].
Биопрепарат «Деворойл» представляет собой тщательно подобранное сообщество углеводородокисляющих микроорганизмов, эффективно окисляющих широкий спектр углеводородов нефти, в том числе и ароматические углеводороды, в широком диапазоне кислотности среды (рН 5,5–9,5), температур (5–40°С) и солености среды (до 150 г/л). Специальные добавки, введенные в состав препарата, значительно активизируют процесс деструкции нефти [92]. Известно, что в состав препарата Деворойл входят штаммы Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus maris, Rhodococcus sp., Yarrowia lipolytica (ранее Candida sp.) [93] 
Препарат способен к комплексному разложению как растворимых, так и нерастворимых в воде компонентов нефти (при внедрении в толщу нефтяной пленки). Последнее свойство существенно сокращает время, необходимое микроорганизмам для нейтрализации загрязнения. Продолжительность очистки грунта от нефти и нефтепродуктов, как правило, составляет 2–3 месяца [92].
На базе Вятского Государственного Университета ведется работа по получению биопрепарата в виде концентрированной жидкой суспензии микробных клеток на основе ранее выделенного штамма микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти Pseudomonas delhiensis B-11400. Полученный биопрепарат будет подвергнут качественному анализу на деградацию углеводородов нефти.
Степень эффективности планируемой работы с биопрепаратами во многом будет зависть от следующих факторов:
количество вылившихся нефтепродуктов, площадь, глубина и степень загрязнения почв и вод;
возраст загрязнения и,осоответственно, текущий состав нефтепродуктов;
распределение углеводородов по компонентам почвы и гидросферы, их биодоступность;
продолжительность вегетационного периода (с круглосуточно положительными значениямиотемпературы воздуха и поверхностиопочвы);
тип, влагосодержание, кислотность и другие физико-химические параметры загрязнённой почвы или нефтешлама, их целевое назначение, а также особенности местного микробиоценоза, растительности;
возможность принудительной аэрации загрязнённого объекта;
местные нормативы предельнодопустимого содержания нефти и нефтепродуктов в грунте (например, стандарт ЕС чистой почвы составляет 400оppm, а в РФ экологи иногда поднимают эту планку до фоновых 100оppm) [94].
Оптимальной влажностью для процессов биодеструкции углеводородов нефти в почве является значение от 60одо 65%, и для стимулирования естественных процессов самоочистки необходим регулярный полив.
Биодеградация углеводородов происходят в аэробной среде. Обеспеченность кислородом зависит от типа почвы, ее влажности, природы субстрата, структуры микробного сообщества, и нередко возникает необходимость проводить периодическое рыхление. Кислотность почвы играет также важную роль - в природных условиях микроорганизмы-биодеструкторы активны в узкой области pH (нейтральные, или близкие к нейтральным значения). Оптимальный уровень рН создается при помощи агрохимических мероприятий. Для стимуляции деятельности микроорганизмов необходимо проводить химическую мелиорацию с внесением минеральных солей. Расчет доз минерального питания микроорганизмов производится после определения доступных форм азота, фосфора, калия, магния на объекте и установления недостающего количества элементов питания до оптимальной концентрации. В первом приближении исходят из того, что на потребление микроорганизмамии1 части УВ теоретически необходимо 0,1-0,15ччасти биогенных элементов, причем половина из них приходится на азот (в аммонийной форме), а оставшаяся часть - в равном соотношении на фосфор и калий. Для ускорения очистки иногда добавляют навоз и опилки в количестве 25%оот массы нефтесодержащих осадков [95].
Количество и тип биопрепаратов для утилизации углеводородов определяется природой загрязнения, его концентрацией, химическим составом сопутствующих веществ и условиями проведения работ. На основании результатов лабораторных и полевых исследований подтверждено изменение степени биодеградабельности различных компонентов загрязнения в соответствии со следующей закономерностью (в порядке убывания): растительные масла > пищевые жиры > парафины > дизельное топливо, керосин, бензин, газовый конденсат > нефтемасла > мазут > сырая нефть. Таким образом, ориентировочное соотношение биопрепарат/загрязняющие вещества выражается следующими данными:
- сырая нефть, мазут, кондесированные ароматические УВ – 1:10;
- машинное и моторное масла, вазелины, тяжелые фракции парафинов - 1:100;
- газовый конденсат, дизельное топливо, бензин, керосин, авиационное топливо, циклоалканы - 1:1000;
- н-алканы, растительные масла и животные жиры - 1:10000.
Из-за неравномерного химического и минералогического состава почв различных регионов на практике количество биопрепаратов определяется по результатам химического анализа объекта, подвергаемого очистке. Принимается, что для утилизации 1 т сырой нефти требуется не менее 5 кг биопрепарата. Естественно, что в природных условиях с непостоянством климатических и физико-химических параметров, а также наличием факторов, ингибирующих рост микроорганизмов, продолжительность утилизации значительно возрастает и требует не только увеличения стартовых количеств, но и дополнительных внесений биопрепаратов и минеральных удобрений [96].
Практически для всех известных коммерческих препаратов предусматривается применение фиторемедиации высевом устойчивых к загрязнению однолетних и многолетних трав и злаков, что является необходимым элементом биорекультивации почв от нефти. Рост и развитие трав способствует закреплению грунта и ускоряет разложение остаточного углеводородного загрязнения в более глубоких слоях почвы. Преимущество разрабатываемого нами препарата заключается в том, что очистка почв от нефтезагрязнений будет основана на процессах био- и фиторемедиации, заложенных в его конструкции. Кроме того в основе создания биопрепарата лежит метод иммобилизации клеток на сорбенте естественного происхождения, в качестве которого предлагается использовать семена растений-фиторемедиантов. В состав растительно-микробной ассоциации кроме штамма Pseudomonas delhiensis B-1140 - деструктора углеводородов нефти входят так же бактерии рода Rhizobium, которые положительно влияют на рост вышеуказанных растений и тем самым повышают эффективность деградации нефти.
1.2.2 Фиторемедиация
Нефтезагрязнение - как в рамках масштаба, так и по свойствам токсичности представляет из себя общепланетарную и мировую опасность. Нефть и нефтепродукты способны вызывать острое отравление и гибель почвенных организмов и, в конечном итоге, деградацию самой почвы. Сам процесс естественного самоочищения природных объектов от загрязнителя является очень длительным. По этой причине наибольшую актуальность придают проблеме, связанной с рекультивацией загрязненных почв [97].
Одним из перспективных методов восстановления нефтезагрязненных почв является их фиторемедиация. На современном этапе очистки биосферных комплексов наибольший интерес представляет развитие фиторемедиационных технологий очистки нефтезагрязненных почв с помощью высших растений. Данный процесс предоставляет возможность использования ассоциаций растений с микроорганизмами, предназначенных для очистки окружающей среды. В данном методе применяются природные процессы, с помощью которых растения и ризосферные микроорганизмы деградируют и накапливают различные поллютанты [98].
За прошедшее десятилетие метод фиторемедиации приобрел высокую популярность среди других методов данной области применения, и это отчасти можно связать с его низкой затратной стоимостью. Данный процесс является в разы дешевле механических методов ликвидации нефти, так как не требует применения специализированной техники и основывается только на использовании солнечной энергии. Так же тот факт, что метод может быть применим прямо на месте загрязнения способствует уменьшению затрат и снижению прямого контакта загрязнённого субстрата с человеком и окружающей природной средой.
В последние- годы для интенсификации растениеводства- в практику сельского- хозяйства стали внедрять электротехнологические- методы воздействия на растения и семена- зерновых и овощных-культур с целью их стимуляции - ускорения-роста, повышения-урожайности и улучшения качества получаемой- продукции.
1.2.2.1 Растения, применяемые в фиторемедиации нефтезагрязненных почв
Метод фиторемедиации включил в себя обширный спектр метаболических- процессов по поглощению, -аккумуляции и -разложению органических и -неорганических -загрязнителей. Основное внимание в процессе отработки данной технологии фиторемедиации почв от нефтезагрязнения, соответственно, уделяют отбору растений, которые способны к трансформации загрязнителя и переводу его в менее -подвижную и активную форму. Данный процесс осуществляется совместно с симбиотическими микроорганизмами [99].
Основной принцип работы фиторемедиации заключается в том, что само разложение углеводородов нефти осуществляется собственно не самим растением, а ризосферными микробами.
В свою очередь растения достаточным образом способны оказывать влияние на концентрацию, -разнообразие и биологическую активность микробов благодаря биологически активным корневым выделениям. В области корневой системы часто активно развиваются микроорганизмы, способные образовывать необходимые для утилизации ксенобиотиков различные ферменты [100].
Производя выбор растения - фиторемедиатора, нужно принимать во внимание разные факторы (тип и структура почвы, рН, содержание солей, концентрация металлов, наличие паразитов, и возможное количество осадков в течении биоремедиации). Сначала выбирают тип фиторемедиационной технологии и уже под данную технологию подбирают фиторемедиант.
Для того чтобы с максимальной выгодой использовать весь экологический потенциал растений-ремедиантов нужно проводить селекцию по некоторым важным критериям. Основными требованиями, которые предъявляют к таким растениям. Является их толерантность к загрязнителю и способность к депонированию неорганических и органических поллютантов в своем внутриклеточном пространстве. Среди дополнительных требований выделяют возможные колебания температуры, действие вредных насекомых, галофильность и т.д. [101].
В отношении технологической составляющее фиторемедиации особое внимание уделяют важнейшему органу растения – корням, которые способны впитывать в себя вместе с органикой почвы токсичные соединения. Так же корни могут выделять в почву экссудаты, которые при совместной работе с внутриклеточными ферментами корневой системы осуществляют первые-этапы трансформации токсичных соединений почвы. Благодаря этому, можно сделать вывод, что наиболее важными факторами процесса фиторемедиации являются не только тип собственной корневой системы растения-ремедианта (стержневой, мочковатый), но и их разветвленность.
В ряде случаев наиболее рациональным может оказаться применение монокультуры, но, при этом, также обширное количество исследований, указывающих на успешное применение смешанных культур или чередование культур [102].
1.2.2.2 Технологии проведения фиторемедиационных мероприятий
Метод фиторемедиации предполагает использование растений и ризосферных микроорганизмов, причем в процессе они могут использоваться различными способами.
Одним из таких способов является ризофильтрация. Она предполагает использовать растения в специальных фильтрационных установках для загрязнённой воды. Здесь растения играют роль фильтров в искусственно созданных заболоченных участках или в промышленных установках. Для таких сооружений часто используют разнообразные водные виды растений: ряска (Lemna sp. и Azolla sp.) - для неорганических поллютантов (хорошие накопители металлов и лёгкий сбор биомассы), виды родов Myriophyllum (перистолистник) и Elodea (элодея) -для органических поллютантов (высокий уровень деградирующих ферментов). Сам процесс ризофильтрации сопровождается интенсивным аэрированием, это в дальнейшем может способствовать использованию и наземных растений. Таким образом используются горчица Helianthus annuus и подсолнечник Brassica juncea. Для интенсивной очистки и доочистки от широкого спектра органических (гербициды, взрывчатые вещества) и неорганических поллютантов (металлы, цианиды, нитраты,-фосфаты) искусственно создают заболоченные территории. Но по причине того, этот способ требует значительных денежных вложений, он не пригоден для ремедиации небольших количеств сточных вод, содержащих опасные- неорганические поллютанты, например, радионуклиды [103].
Для того, чтобы создать препятствие горизонтального распространения загрязнённых грунтовых вод для можно использовать древесные виды растений, так как они способны создавать восходящий ток воды в корневую зону, и тем самым препятствуя утечке загрязнения вглубь почвы. С этими целями применяются растительные виды с хорошо-развитой корневой системой и высоким уровнем транспирации (например, тополь) [104].
Еще одним из вариантов фиторемедиации является фитоэкстракция. Смысл ее заключается в применении растений в качестве экстрагента для поллютантов и дальнейшем аккумулировании их в растительных тканях, после чего надземная растительная биомасса собирается. Растительный материал может далее либо использоваться для непищевых целей (производство дерева, картона) либо сжигаться-с последующим вывозом золы на свалку или, в случае ценных металлов, рециркуляцией накопленных элементов. Данная технология главным образом используется для очистки от неорганических поллютантов (металлы, селен, мышьяк, радионуклиды). Для фитоэкстракции часто применяют горчицу Brassicajuncea и подсолнечник Helianthusannuus из-за их быстрого роста, большой биомассы и высокой устойчивости к неорганическим поллютантам. Также обнаружен ряд растений-гипераккумуляторов, способных накапливать один или несколько элементов (некоторые-металлы, As, Se) до уровня в-два порядка выше, чем другие-виды (до 0,1-1% сухой-биомассы). Так, растение, гипераккумулирующее никель, Alyssum bertolonii (Бурачок Бертолони),уже применялось в полевых условиях для фитоэкстракции [105].
Принцип работы фитостимуляции состоит в использовании растений для стимуляции биодеградации поллютантов микробами в ризосфере. Такая стимуляция биодеградации осуществляется за счёт секреции растениями органических веществ, используемых ризосферными микроорганизмами в качестве источника-энергии и углерода, а также различных вторичных метаболитов, активирующих гены, ответственные за синтез деградирующих ферментов. Для фитостимуляции микробов-деструкторов корневой зоны применяются растения обладающие обширной плотной корневой системой и секретируюшие специфические вещества, способствующие росту микробов. В частности используются различные травы (например, овсянница Festuca sp., клевер Lolium sp.) из-за их обширной и плотной корневой системы и шелковица (тутовое дерево) из-за секреции фенольных соединений - индукторов генов микроорганизмов вовлечённых в разрушение циклических углеводородов. Фитостимуляция применяется для очистки от гидрофобных органических поллютантов (ПХБ, углеводороды нефтепродуктов), которые не могут быть поглощены растениями, но могут быть деградированы микробами [106-107].
Помимо всего выше изложенного растения могут напрямую способствовать деградации органических поллютантов благодаря помощи своих ферментов, обычно внутри тканей, до неорганических соединений, накапливающихся в тканях растения. Технология использования растений для деградации поллютантов получила название фитодеградация. Она эффективна против неорганических поллютантов обладающих хорошей подвижностью в растении (гербициды, тринитротолуол - ТНТ, трихлорэтилен). Применяемые для фитодеградации виды характеризуются наличием обширной плотной корневой системы и высоким уровнем синтеза ферментов деградации (наиболее часто применяют растения тополя) [108].
Технология, получившая название фитоиспарение, основывается -на том, что после поглощения некоторые поллютанты могут покидать растение в летучей малотоксичной форме. Например, неорганический селен ассимилируется растением в форме селеноаминокислот – селеноцистеина и селенометионина. Последний может метилироваться с-образованием летучего диметилселенида на 2-3 порядка менее токсичного, чем неорганический селен. Если летучее соединение всё же токсично, то после испарения растением оно разбавляется в атмосфере до уровня не представляющего угрозы. Фитоиспарение может-быть использовано для летучих органических соединений (трихлорэтилен) и некоторых неорганических веществ, способных переводиться растением в летучее состояние-(селен, ртуть). Обычно в данной технологии применяют всё тот же тополь благодаря высокому уровню-транспирации [109].
Фиторемедиация является высокоэффективной технологией чистки от ряда органических и неорганических поллютантов [110].
Органические поллютанты в окружающей среде представлены, главным-образом, веществами антропогенного происхождения, и для большинства организмов являются чужеродными (ксенобиотиками); многие из них токсичны, некоторые канцерогенны. В зависимости от их свойств, органические поллютанты могут или разрушаться в корневой зоне растений, или поглощаться с последующим-разрушением, изолированием или испарением. Фиторемедиация успешно применяется для очистки от таких органических поллютантов как органические растворители (например, трихлорэтилен, наиболее распространённый поллютант подземных вод), гербициды (атразин), взрывчатые вещества, углеводороды (нефть, бензин, бензол, толуол, полициклические ароматические), полихлорбифенилы (ПХБ) [111].
Поллютанты неорганического происхождения часто встречаются в составе земной коры или атмосферы и являются естественными их составляющими, а человеческая деятельность способствует их высвобождению в окружающую среду, приводя к её загрязнению. Неорганические поллютанты не могут быть деградированы, однако фиторемедиации может привести к очистке среды от этих поллютантов путём их стабилизации или изолирования в тканях растения. Фиторемедиация может-быть успешно применена для очистки от ряда неорганических поллютантов, включая макроэлементы растений-(нитраты, фосфаты),-микроэлементы (такие как Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn), несущественные для растения-элементы (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, V, W) и радиоактивные изотопы (U238, Cs137 и Sr90) [112].
Ремедиация окружающей природной среды с помощью растений может включать в себя следующие этапы: благодаря своей корневой системе растения способны активно поглощать вещества химического происхождения – процесс ризофильтрации, тем самым накапливая и удерживая в себе токсичные соединения – фитоэкстракция, летучие химические соединения могут выводиться из растения, испаряясь с поверхности листьев – фитоволатилизация, остальные-вещества переводятся в менее активную форму, разлагаясь до более простых – фитостабилизация, часть органических соединений разрушается-с помощью микроорганизмов – фитодеградация.
Растение как биофильтр, который способен создавать благоприятные условия для почвенных микробов, которые стоят на первом-месте в процессе деградация загрязнений, снабжая их нужными питательными веществами.
Данная технология отличается не только положительными характеристиками, она имеет и недостатки. Один из таких недостатков состоит в длительности, к примеру, период полураспада тяжелых металлов находится в пределах от 50-лет до сотен и тысяч лет. Глубина очистки является здесь лимитирующим фактором, она может ограничиваться лишь длиной роста корней, которая в среднем у большинства травянистых растений достигает метра, у деревьев-до 2 м. Такой метод очистки наиболее эффективен только при загрязнении низкого или среднего уровня, и применяется обычно на завершающей стадии ремедиации почвы, для улучшения ее свойств. Накопление токсикантов внутри растительных тканей делает его наиболее опасным для живых существ и может в конечном итоге привести к распространению токсичных веществ по пищевой цепи.
Ссылаясь на Федеральный классификационный каталог отходов, нефтезагрязненная почва и почвогрунт, относятся к опасным для окружающей природной среды отходам.
Сельскохозяйственные растения ввиду своих физиологических особенностей реагируют на нефтяные поллютанты по разному даже если уровень этого загрязнения одинаковый. Очевидно, что очистка загрязненных углеводородами нефти почв может-быть оценена по функции «почва – растение», а это зависит-от подбора сельскохозяйственных культур [113].
Способ, восстанавливающий загрязненные почвы в широком спектре, заключается в возделывании многолетних трав, так как он во многом подходит для первоначального этапа рекультивации сельскохозяйственных и лесных угодий.
С точки зрения восстановления агроценозов данный подход использования многолетних трав вызывает некоторые сомнения, т. к. другие растительные культуры в сравнении с многолетниками могут оказаться менее восприимчивыми к негативным изменениям эдафона [114].
В целях биоиндикации изменения функциональных свойств почвы, загрязненной нефтью, по реакции сельскохозяйственных растений, имеющих разную чувствительность к неблагоприятным факторам среды, был проведен вегетационный опыт. Экологические функции загрязненной нефтью почвы оценивались по деградации её свойств, а именно: фитотоксичность, обеспеченность азотом, гумусное состояние, структурные и водно-физические показатели.
Для вегетационного опыта использовалась почва из пахотного горизонта выщелоченного среднесуглинистого чернозема на покровном лессовидном суглинке. Доза вносимой нефти составляла 10000 мг/кг почвы, что соответствует очень высокому уровню загрязнения, поскольку превышает ориентировочно-допустимое количество (ОДК) нефти-в почве в 10 раз [115]. Загрязнение почвы нефтью проводилось до посева сельскохозяйственных культур. Контролем служила чистая почва свободная от загрязнения из того же почвенного горизонта. Таким образом выращивали кукурузу на зеленую массу, клевер на сено, газонные травы (райграс, мятлик, овсяница), овес, ячмень. Причем опыт проводили в пятикратной повторности.
Оценку реакции растений на наличие поллютантов в почве давали визуально в процессе непосредственно вегетации, а также по урожайности сельскохозяйственных культур. Деградационную активность почвы определяли в конце вегетационного периода по следующим параметрам: фитотоксичность, углеродно-азотное соотношение, агрегатный состав почвы, водоудерживающая способность [116].
По результатам учтенных данных в конце экспериментального исследования было установлено, что при сильном нефтезагрязнении почвогрунта показатели зависят во многом от индивидуальных характерных растительных особенностей. Наиболее рекомендуемые и часто используемые на этапе биологической рекультивации травы (райграс, мятлик, овсяница, клевер), но при загрязнении нефтью 10 г/кг данные травы не подходят. В последнем случае лучше будет применять овес [116].
После засева трав, исследователи проводили проверку на остаточную токсичность почвы. Из полученных данных в ходе исследований сделали вывод, что скорость разложения нефти в почве убывает в ряду культур следующим-образом: ячмень → клевер → газонные травы → овес → кукуруза [116].
1.2.3 Сочетание процессов био- и фиторемедиации. Составление растительно-микробных ассоциаций
Термин фитобиоремедиация, то есть сочетание процессов фиторемедиации и биоремедиации, означает использование растений в комплексе с ассоциированными с ними микроорганизмами для очистки окружающей среды от различных загрязнителей. В данном методе используются исключительно природные процессы, благодаря которым растения и микроорганизмы ризосферы способны деградировать и накапливать различные поллютанты. Фитобиоремедиацию по праву можно считать высокоэффективной технологией биоочистки от широкого спектра загрязнителей различного происхождения, в том-числе и от нефтепродуктов.
Загрязнители органического состава, попадая в условия окружающей среды, представляют из себя, в большинстве случаев, вещества антропогенного происхождения, и оказываются для большинства организмов токсичными, а некоторые из них даже канцерогенными. Данные вещества, в зависимости от их состава и свойств, могут подвергаться различным воздействиям со стороны фиторемедианта - либо разрушаться в зоне корней, либо поглощаться с дальнейшим разрушением. Фитобиоремедиация с успехом используется для биоочистки от многих органических загрязнителей, попадающих в окружающую среду, например, органические растворители (тетрохлорэтилен), гербициды (паракват), взрывчатые вещества (натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы), углеводороды-(нефть, толуол, керосин, бензин, дизельное топливо, бензол) и т.д.
Загрязнители неорганического происхождения могут быть встречаются как естественные компоненты почвенного покрова или атмосферы-воздуха, при этом деятельность-человека во многом влияет на их высвобождение, приводя к загрязнению окружающей среды. Вещества такого рода не могут в достаточной мере подвергаться процессу деградации, но фитобиоремедиация может не только способствовать, но и привести к биоочистке окружающей среды от данных поллютантов методом их стабилизации либо способом изолирования в растительных тканях. Фитобиоремедиация с успехом применима для биоочистки от таких неорганических веществ как, растительные макроэлементы, микроэлементы (Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, Zn), элементы, являющиеся для растений несущественными (Cd, Co, F, Hg, Se, Pb, V, W) и радиоактивные вещества (U238, Cs137).
Фитобиоремедиация применима для биоочистки объектов, находящихся в разных агрегатных состояниях, то есть как твёрдых, так и жидких и воздушных субстратов. Фитобиоремедиация широко применяется для очистки загрязнённых почв различного целевого назначения, например, военных-полигонов, сельскохозяйственных угодий, промышленных зон, мест деревообработки. Помимо загрязненных почвогрунтов фитобиоремедиации подвергаются загрязнённые воды: сточные воды населенных пунктов, сточные воды агропромышленных комплексов, загрязненные металлами грунтовые воды.
За последнее десятилетие фитобиоремедиация получила широкое применение и большую популярность, с экономической точки зрения, во многом это связано с её низкой затратностью. Это объясняется тем, что в данном процессе используются исключительно природные процессы, например, энергия солнца. Этот метод на порядки экономичнее, а, следовательно, и дешевле технологий, основанных на использовании существующих техник, например, промывка или сжигание почвы. Одним из важнейших плюсов фитобиоремедиации является то, что эта-технология может быть применима непосредственно в зоне загрязнения, то есть in situ, это так же может способствовать снижению всех затрат и сведению к минимума контакта загрязнённого объекта окружающей среды с человеком. Фитобиоремедиация благодаря своей низкой затратности и эффективности приобрела одобрение у широкой массы общественности как экономически выгодный и экологически-чистый метод, являющийся альтернативой механическим и автоматизированным техникам. Вследствие этого, многие предприятия и организации преимущественно включают фитобиоремедиацию в процесс, связанный с очисткой окружающей природной среды.
На сегодняшний день на процесс фитобиоремедиации на территории США тратиться порядка $100-150 млн. ежегодно, что в итоге составляет-0,5% от всех существующих затрат в данной области на биоочистку окружающей природной среды. Для сравнения: на биоремедиацию, которая отличается только использованием микроорганизмов, приходится порядка 2%. На общем фоне в 8о из 100 случаев фиторемедианты используются в области биоочистки от органических загрязнителей и в 20% случаев - от веществ неорганического происхождения. Тенденция к использованию фитобиоремедиации в Европе не имеет такого широкого применения как в США. Однако, эта ситуация в скором времени изменится в лучшую сторону, и это связывают с ростом интереса к данному процессу и растущим финансированием экспериментальных исследований в данной научной области. Помимо этого, огромное влияние на интерес к применению фитобиоремедиации оказывает и наличия больших площадей районов загрязнённых поллютантам. Положительным критерием при выборе фитобиоремедиации как метода для биоочистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов в развивающихся странах является его эффективность и экономичность, это связывают и его низкой стоимости и простотой применения.
Важным условием в данном процессе биоочистки является уровень глубины проникновения корней фиторемедианта в загрязненный почвенный субстрат. При проведении фитобиоремедиации необходимо соблюдать общие принципы: растения-фиторемедианты, способные к биоочистке, должны быть расположены непосредственно в зоне загрязнения и быть готовыми в полной мере к воздействию на загрязнитель. При этом ничто не должно препятствовать хорошему росту фиторемедианта, положительное влияние должны оказывать состав и физические свойства почвогрунта, уровень токсичности и климат. В обратном случае, если уровень токсичности почвы достаточно велик и оказывает угнетающее воздействие на рост фиторемедианта, то необходимо создать более пригодные условия для роста путем внесения в почву различных добавок, снижающих уровень токсичности и благоприятно влияющих на рост растений.
Ещё одно важное условие для успешного проведения процесса фитобиоремедиации заключается в непосредственном контакте фиторемедианта с загрязнителем. Глубина проникновения корней у разных растений различна, например, корни травянистых растений проникают на глубину 0,5 м, корни деревьев – 3 м, не смотря на это некоторые виды представителей флоры имеют способность проникать на глубину более 15 м. Данные значения не являются предельными для фитобиоремедиации, их можно преодолеть с помощью более глубокой посадки, например, в скважины глубиной до 12 м. Деградация загрязнителей в процессе фитобиоремедиации растениями достигается достаточно быстро и занимает считанные дни или месяцы.
Необходимо принимать во внимание и факт доступности загрязнителя для фиторемедианта. В этом случае биодоступность может зависеть от многих факторов: химический состав загрязнителя почвогрунта, физические свойства почвы, климатические условий окружающей среды и т.д. Уровень биодоступности загрязнителей для растения может быть изменен способом внесения в почвогрунт добавок, например, органические кислоты или сурфактанты.
Для того чтобы достичь максимального эффекта биоочистки в процессе фитобиоремедиации, может использовать комплекс мероприятий по рекультивации загрязненных земель и водных объектов, например, сочетание фитобиоремедиации с небиологическими методами очистки.
Почвы и воды загрязненные поллютантами в результате аварий при транспортировке, неудачных эксплуатационных приемов добычи-нефти и других причин наносит значительный ущерб экологии, рыбному и сельскому хозяйству. Рекультивация таких земельных угодий и восстановление поверхностных загрязненных вод представляет из себя обширный спектр мероприятий. Повсеместно в мире интенсивно проводятся экспериментальные исследования по вопросу изучения влияния нефтяных поллютантов на природную среду, разрабатываются различные методы и способы ускорить процесс окисления нефти в почве или на поверхности воды. Было установлено, что микроорганизмы-деструкторы углеводород нефти в консорциуме с растениями-фиторемедиантами способны выступать в качестве катализаторов, способствующих быстрому и качественному разложения нефти и нефтепродуктов. Факторы абиотической природы прямого непосредственного влияния на деградационный процесс не оказывают: их действие оказывается существенную роль исключительно на жизнедеятельность микроорганизмов-нефтеокислителей (это, например, температура, влага и т. п.). Растительно-микробные ассоциации используют на практике методом внесения их в состав почвы в виде разнообразных биологических препаратов [117-119].
Стоит так же иметь в виду, что непременным условием использования таких ассоциаций в составе биопрепарата для ремедиации почв, загрязненных углеводородами нефти in situ,является наличие технологий, обеспечивающих его производство в больших количествах.
Глубинное культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов – является основным этапом в технологии получения биопрепарата, от условий и режимов проведения которого во многом зависят его количественный и качественные характеристики. Оптимизация процесса культивирования должна быть направлена на достижение максимального выхода биомассы, характеризующейся деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти. По завершению этапа глубинного культивирования полученную культуральную жидкость необходимо сконцентрировать – это второй этап на пути получения биопрепарата. В дальнейшем полученные концентраты оценивают по содержанию в них типичных по морфологии живых микробных клеток используемых штаммов. На заключительной стадии просихлдит процесс смешивания концентрата и составления растительно-микробных ассоциаций.
Актуальность решения представленной выше проблемы вызвала большой научный интерес и у Вятского государственного университета (ВятГУ). Так на кафедре микробиологии ВятГУ проводятся работы в рамках темы НИР «Симбиоз», суть которой заключается в разработка биопрепарата на основе растительно-микробных ассоциаций, предназначенного для ремедиации нефтезагрязненных почв. На начальных этапах научной работы из проб образцов почвы были выделены и идентифицированы углеводородокисляющие микроорганизмы (УВОМ), а так же на базе исследовательской лаборатории НИИСХ С-В им. Н.В. Рудницкого были выделены и предоставлены для дальнейшего исследования лаборатории кафедры Микробиологии ВятГУ клубеньковые бактерии рода Rhizobium, из которых в последующем была сформирована бактериальная коллекция. Проведенный скрининг микроорганизмов из коллекции на основании оценки их способности к биодеградации и детоксикации углеводородного загрязнения позволил отобрать штамм – деструктор рода Pseudomonas, отличающийся наилучшей углеводородокисляющей активностью. Данный штамм в 2013 году был депонирован в ВКПМ как Pseudomonas delhiensis B-11400 [84]. Кроме того в основе создания биопрепарата лежит метод иммобилизации клеток на сорбенте естественного происхождения, в качестве которого предлагается использовать семена растения-фиторемедианта (Лядвенец рогатый). В состав растительно-микробной ассоциации кроме штамма Pseudomonas delhiensis B-1140 - деструктора углеводородов нефти входят так же бактерии рода Rhizobium, которые положительно влияют на рост вышеуказанных растений и тем самым повышают эффективность деградации нефти [84].
1.2.3.1 Получение микробного компонента
В общей сложности все биотехнологического производства можно разделить на 2 группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. В рамках данного научного проекта нам необходимо получить биомассу микробных клеток и в дальнейшем на ее основе получить концентрированный биопрепарат микроорганизмов-нефтедеструкторов. Но такая классификация не отражает наиболее существенных-с технологической точки зрения аспектов промышленных биотехнологических процессов. В этом плане необходимо рассматривать –стадии биотехнологического производства, их сходство и различие в зависимости от конечной цели биотехнологического процесса.
Существует 5 основных стадий биотехнологического производства. Две первые начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. Они обычно состоят из приготовления-раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки посевного материала. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистоты используемой культуры микроорганизмов. Поддержание чистой культуры штамма микроорганизмов – это-главная задача любого микробиологического производства.
Третья стадия - это стадия культивирования, на которой происходит процесс нарастания биомассы, то есть идет превращение составляющих питательной среды в биомассу.
На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. К данной стадии относится и получение концентрированной биомассы микробных клеток. Общим-свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению. Поэтому для сохранения полученного концентрата микробных клеток необходимо подобрать протекторные среды для лучшего его хранения.
Получение посевного материала. В биотехнологическом процессе используются полезные свойства штамма, поэтому необходимо сохранять его производственные качества. Так в биотехнологическом производстве проводят операции по сохранению чистоты культуры, задачей которых является постоянное и надежное воспроизведение полезных свойств продуцентов, найденных в свое-время в ходе предыдущих исследований.
Первым этапом процесса биотехнологического производства, предшествующим глубинному культивированию является приготовление посевного материала из чистой культуры микробов. Его получают выращиванием микроорганизмов в бутылях объемом от 10 до 20 литров (крупномасштабное производство) или в колбах объемом от 100 до 250 мл (лабораторное производство). В дальнейшем их помещают на качалки или просто в термостатируемые помещения на 24 часа или более. В данном проекте посевную дозу получали в колбах Эрленмейера на 100 мл в качалках при 180 об./мин. В течение 24 часов.
Периодическое глубинное культивирование микроорганизмов как эффективный способ получения бактериальной массы. Основной стадией в промышленном производстве биологических препаратов оказывается процессе ферментации (глубинного культивирования). Определение включает в себя всю совокупность последовательных операций от внесения инокулята в питательную среду до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации.
Процесс культивирования проводят в предназначенных для этих целей специализированных аппаратах - ферментерах или биологических реакторах. Конструкция такой установки приведена на рисунке 1. Среди основных элементов и биореактора выделяют двойные стенки, промежуток между которыми заполняется охлаждающей или нагревающей жидкостью, входные отверстия для жидких и газовых потоков, система контроля за составом питательной среды и условиями внутри реактора.
Так как в промышленной биотехнологии существует всего 2 типа процессов - накопление биомассы и накопление продуктов метаболизма. Биомасса микроорганизмов выращивается непрерывным способом в аппаратах хемостатного типа, а все-процессы второй группы осуществляются периодически, когда в одном и том же аппарате в производственном цикле протекают все необходимые фазы-развития клеток и биосинтеза. Данные процессы отличаются по требованиям к степени-асептики, что связано с их выходом по объёму.
Оформление всех процессов промышленной биотехнологии с технической точки зрения в значительной мере определяется отношением микроорганизмов-продуцентов к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное оборудование и режимы подбираются таким образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу) обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых для данной культуры в данной фазе роста. Процессы промышленного использование факультативных анаэробов технологически проще аэробных. В начальных фазах требуется лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.

Рисунок 1 - Устройство ферментера
Острыми вопросами в ряде биотехнологических производств являются вопросы по подводу или отводу тепла в ходе ферментации являются очень. В аэробных условиях микробиологический синтез протекает со значительным тепловыделением, что вызывает необходимость отвода тепла из аппаратов. Наиболее приемлемый на практике способ теплоотвода – это охлаждение водой через змеевики, рубашки и др. Также важно поддерживать определенный состав питательной среды и оптимальное значение рН в биореакторе, которое поддерживается дозированным введением кислоты или щелочи.
В рамках исследовательской работы глубинное культивирование микробов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 и штамма клубеньковых бактерий рода Rhizobium проводили глубинного периодического культивирования с помощью автоклавируемого ферментера типа LiFlus GX производства Bio-Tron Inc. Основные методы выделения и очистки микроорганизмов. В конце процесса культивирования биомасса микробных клеток в ферментере находится в состоянии суспензии или раствора при этом характерно наличие многих компонентов в виде примесей.
В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости идет разделение массы клеток микроорганизмов от жидкостной фазы – сепарация. Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал) возможно и методом фильтрации. Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной илы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.
Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с-помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально-подобранным размером пор.
Все-методы выделения--продуктов микробиологического синтеза из культуральной жидкости делят на две группы:
1. экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация, если целевой продукт в растворе;
2. осаживание, фильтрование, центрифугирование, сепарирование, если целевой продукт в виде твердой фазы.
Часто применяют комбинацию нескольких методов. Как правило, при выделении растворенных веществ культуральную жидкость приходится подвергать предварительной обработке и очистке с помощью осаждения, фильтрования, центрифугирования, сепарирования и мембранных методов (электродиализ, ультра- и микрофильтрация).
Осаждение (седиментация) - это-процесс расслоения дисперсных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы в осадочном виде.
Скорость осаживания биомассы из культуральной жидкости невелика и составляет порядка 106-107 м/с. Для ускорения процесса-осаждения применяют:
1. коагулянты - вещества, которые переводят взвешивание частиц в агрегатно-неустойчивое состояние, например, желатин, рыбный клей, казеин;
2. флокулянты — вещества, которые способствуют разрушению коллоидных структур и образованию крупных хлопьев это, например, метилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия.
Центрифугирование - это-разделение неоднородных систем под воздействием поля центробежных сил.
Для центрифугирования применяют центрифуги различных конструкций.
Центрифуги, оснащенные тарельчатыми барабанами, носят название сепараторы. В микробиологической промышленности сепараторы являются одним из самых распространенных типов центрифуг и позволяют сконцентрировать осадок до содержания-влажности около-60-90%.
Фильтрация - это-разделение твердой и жидкой фаз суспензии при пропускании ее через пористую перегородку.
Это гидродинамический процесс, скорость которого прямо пропорциональна разности давлений, создаваемой по обеим сторонам фильтровальной перегородки и обратно пропорциональна сопротивлению, испытываемому жидкостью при ее движении через поры перегородки и слой образовавшегося осадка.
Сепарация – процесс разделения смешанных объёмов разнородных частиц-жидкостей разной плотности, эмульсий, твёрдых материалов, взвесей твёрдых частиц или капелек в газе. При сепарации не происходит изменения химического состава разделяемых веществ. Сепарация возможна если присутствуют различия в характеристиках компонентов в смеси: в размерах твёрдых частиц, в их массах, в форме, плотности и других.
Свойства, отличающие продукты сепарации, не обязательно должны совпадать-с признаками, по которым разделяют смесь компонентов в производстве. В самом процессе сепарации принимает участие очень большое количество отдельных мелких частиц, среди которых встречаются частицы-с промежуточными свойствами по отношению к необходимым признакам. Из исходной смеси после сепарации не могут получиться абсолютно-чистые фракции разделяемых компонентов, а лишь продукты с преобладающим их содержанием.
Выбор способа-сепарации зависит от процентного состава и свойств разделяемой смеси и составляющих её компонентов, степени-соответствия желаемых свойств получаемых продуктов от последствий разделения и свойств-компонентов. Сепарация, как правило, происходит не только по главному-признаку, который отличает компоненты в смеси, а по целому ряду свойств. Процессы-сепарации различаются от внешних условий и аппарата, в котором происходит разделение. В современном производстве для различных целей и смесей применяется разнообразные способы сепарации:
сепарация по массе (инерционная);
размеру;
упругости;
трению;
воздушная сепарация;
электрическая;
магнитная;
пенная;
радиометрическая.
Флотация – это способ разделения смесей, при котором пузырьки газа или капли масла прилипают к плохо смачиваемым водой частицам и поднимают их к поверхности. 
В зависимости от характера и способа образования межфазных границ, на которых происходит закрепление разделяемых компонентов, различают несколько видов флотации.
Масляная. При перемешивании с маслом и водой компоненты смеси избирательно смачиваются маслом и всплывают вместе с ним на поверхность воды.
Пленочная. Основана на способности гидрофобных частиц удерживаться на поверхности воды, в то время как гидрофильные тонут в ней.
Пенная— при которой через смесь частиц с водой пропускают мелкие пузырьки воздуха, частицы собираются на поверхности раздела фаз «воздух-жидкость», прилипают к пузырькам воздуха и выносятся с ними на поверхность в составе трехфазной пены. Пену в дальнейшем сгущают и фильтруют.
Для образования пузырьков предлагались различные методы: образование углекислого газа за счёт химической реакции, выделение газа из раствора при понижении давления - вакуумная флотация, энергичное перемешивание пульпы, пропускание воздуха сквозь мелкие отверстия.
Пенная флотация — гораздо более производительный процесс, чем масляная и плёночная флотации. Этот метод применяется наиболее широко.
Электрофлотация — перспективный метод для применения в химической промышленности, заключается во всплытии на поверхности жидкости дисперсных загрязнений за счет выделения электролитических газов и флотационного эффекта.
Для очистки воды в 1950-х годах был разработан метод ионной флотации, перспективный для переработки промышленных стоков, минерализованных подземных термальных и шахтных вод, а также морской воды. При ионной флотации отдельные ионы, молекулы, тонкодисперсные осадки и коллоидные частицы взаимодействуют с флотационными реагентами-собирателями, чаще всего катионного типа, и извлекаются пузырьками в пену или плёнку на поверхности раствора.
Существуют так же и мембранные методы разделения смесей. К ним относятся:
диализ и электродиализ;
обратный осмос;
микрофильтрация;
ультрафильтрация.
В основе методов лежит явление осмоса - диффузии растворенных веществ через полупроницаемую перегородку (мембрану) с большим количеством пор (до 10*1010 на 1 м2) с диаметром не более 0,5 мкм.
Мембрана это высокопористая или беспористая плоская или трубчатая перегородка из полимерного или неорганического материала, способная разделять различные виды частиц, находящиеся в смеси или растворе. К основным мембранным методам разделения жидких систем относятся обратный осмос, ультра- и микрофильтрация.
Для получения концентрированной микробной суспензии в рамках данного научного исследования использовали способ мембранного концентрирования с помощью установки «Сартокон - мини» [120].
1.2.3.2 Подготовка растительного компонента. Метод инокуляция семян растений-фиторемедиантов
Инокуляция – это прививание (обработка) семян растений культурой м/о. Это обычно производится прямым нанесением инокулируемого материала на семена перед посевом, либо его дозированным внесением в семенную борозду во время посева [121].
Для каждого растения требуется свой собственный вид бактерий.
Попадая на семена, они выполняют различные функции, в зависимости от цели такой обработки. Например, при обработке семян бобовых клубеньковыми бактериями Rhizobium их урожайность повышается. При обработке вообще любых семян бактериями Bacillius повышается их устойчивость к грибковым заболеваниям. Того же эффекта можно добиться и пестицидами. Хотя в этом случае правильнее называть такую обработку протравливанием [122].
На данный момент в большинстве случаев слова «инокуляция» и «протравливание» означают один и тот же процесс, однако есть нюанс. Механизмы работы различных пестицидов и бактерий, нанесенных на поверхность семян, несколько отличаются. Если пестициды пропитывают ткани защитной оболочки посадочного материала, уничтожая любые микроорганизмы, входящие в контакт с оболочкой, то бактерии расселяются по ней, живут и защищают будущее растение только от своих антагонистов, как правило, защита происходит от болезнетворных грибков и бактерий [123].
В результате такого симбиоза, растение образует новые органы – клубеньки, в которых происходит фиксация молекулярного азота. Количество азота, которое при этом может быть накоплено в почве, составляет доъ600 кг на гектар, что намного превышает потребности самого бобового растения и обеспечивает связанным азотом последующие культуры [124].
Необходимость применения инокулянтов диктуется тем, что в почве преобладают штаммы бактерий, имеющие невысокую эффективность азотфиксации. Для полноценного запуска этого процесса необходимо развитие эффективного симбиотического аппарата на корнях растений, который способен фиксировать молекулярный азот из воздуха и переводить его в доступную для растения форму. Благодаря этому процессу в разы сокращаются затраты на внесение минеральных азотных удобрений. Кроме того, азот, который формируется биологическим путем, абсолютно безвредный, тогда как нитратный азот почвы, накапливаясь в избыточном количестве в растениях, снижает качество получаемой продукции [125].
1.2.4. Практическое применение растительно-микробных ассоциаций
Биопрепараты, в основу которых положены клубеньковые бактерии, применяют до посева семян или вносят в почву, зависит это от особенностей возделывания культуры и препаративной формы инокулята.
Инокуляты различаются на четыре основные группы, по препаратной форме – сухие (обезвоженная биомасса бактерий), жидкие, на твердом носителе (бактерии, адсорбированные на торфе, угле, опиле), гранулированные препараты [126].
Сухие препараты. Основной носитель – торф. Торф обеспечивает жизнеспособность азотофиксирующих бактерий. Эффективность торфа по сравнению с жидкими инокулятами объясняется тем, что он является естественной комфортной средой для азотофиксирующих бактерий, адсорбция на твердом субстрате сокращает до минимума риск несовместимости между разными штаммами, время от момента внесения до «вживления» в корневую систему растений у него больше, чем у жидкого препарата, но в последствии он догоняет и часто перегоняет в эффективности образования клубеньков. Кроме этого, торф защищает бактерий от неблагоприятных воздействий пестицидов [127]. Торфяные препараты вносят прямо в почву либо обрабатывают ими семена растений.
Жидкие препараты обеспечивают максимально равномерное нанесение азотобразующих бактерий на поверхности семян, что на первом этапе позволяет после посева начать вживление на корне растения более активное по сравнению с сухими препаратами. Вместе с тем, в случае снижения температуры после сева, бактерии оказываются в менее благоприятной среде по сравнению с торфяным бактериальным началом. Преимущество жидких препаратов - в удобстве их нанесения на семена. С целью снижения угнетающего воздействия препаратов на бактерии инокулята обработку семян распределяют по времени - вначале обрабатывают протравителями, а перед севом проводят инокуляцию. Вместе с тем надо отметить, что некоторыми жидкими инокулятами можно обрабатывать семена за 90 дней до сева [128].
Получили широкое распространение гранулированные препараты. Гранулы получают из смеси карбоксиметилцеллюлозы и гипса, которые смешивают с жидким препаратом бактерий и подвергают сушке. Другой способ, гранулы в виде частиц монтмориллонита, покрытые смесью торфа и клубеньковых бактерий благодаря спаивающему агенту, которым может быть полиакриламидный гель, полисахариды, мед, кукурузный сироп и многие другие вещества [129]. Существует еще один способ обработки – дражирование – обволакивание семян защитной питательной оболочкой из органо-минеральной питательной смеси, что повышает их всхожесть, энергию прорастания, препятствует распространению болезней и вредителей, обеспечивает дополнительное питание появляющихся проростков, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды. Немаловажно, что при дражировании семена приобретают округлую форму, причём мелкие становятся значительно крупнее. Это облегчает посев и сокращает расход семян. Семена дражируют известняком (активированным углем, глинистыми минералами), далее наносят торфяной инокулят. Преимуществом этого метода является то, что он позволяет нанести большее количество бактериальных клеток, особенно эффективен в отношении мелких размеров семян (люцерна, клевер, лядвенец). Дражирование оберегает клетки бактерий от выделяемого семенами токсичного продукта их обмена веществ.
Номенклатура предлагаемых инокулянтов довольно широка, и остановить выбор на каком-то из них не так просто, в любом случае, надо внимательно знакомиться с качественными показателями препарата, если уже по форме выбор сделан исходя из возможности способа обработки семян. Обработку семян препаратами в смеси со стабилизаторами можно проводить за 20ъдней до посева. Без стабилизаторов – не позднее, чем за 5 дней до посева [130].
Биопрепараты содержат живые микроорганизмы, поэтому обработку семян инокулятами и биопротравителями проводят в защищённом от солнечных лучей месте. Хранить обработанные семена нужно в прохладном, защищённом от солнечного света, месте, а при транспортировке накрывать брезентом [131].
1.3 Выводы по обзору научно-технологической и патентной информации
Загрязнение почвенного покрова нефтью и сопутствующими загрязнителями в настоящее время становится проблемой не только в России, но и в других государствах, что неоднократно отмечалось в числе важных экологических проблем в Государственных докладах о состоянии окружающей среды за последние годы.
Решение данной проблемы требует надежных и вместе с тем дешевых средств и методов. На фоне используемых для данных целей физических, химических и механических методов и приемов, биотехнологические отличаются своей эффективностью, экономичностью и экологической безопасностью. Применение в процессе очистки загрязненных территорий биопрепаратов содержащих живые микробные клетки микроорганизмов – биодеструкторов (биоремидиация), иммобилизированные на носителе естественного происхождения – семена растений-фиторемедиантов, позволяет интенсифицировать процессы самоочищения в почве не вызывая для нее дополнительного ущерба [119].
Первый этап создания биопрепарата заключается в поиске и идентификации микроорганизмов-нефтедеструкторов. Данный этап был выполнен ранее в рамках темы НИР «Разработка экспериментального биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов, предназначенного для биоремедиации загрязненных нефтепродуктами почв Нечерноземной зоны России», а так же в рамках НИР «Симбиоз». В ходе выполнения НИР «Разработка экспериментального биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов, предназначенного для биоремедиации загрязненных нефтепродуктами почв Нечерноземной зоны России» из проб образцов почвы были выделены и идентифицированы углеводородокисляющие микроорганизмы (УВОМ), из которых в последующем была сформирована бактериальная коллекция. Проведенный скрининг микроорганизмов из коллекции на основании оценки их способности к биодеградации и детоксикации углеводородного загрязнения позволил отобрать штамм – деструктор родаPseudomonas, отличающийся наилучшей углеводородокисляющей активностью. Данный штамм в 2013 году был депонирован в ВКПМ как Pseudomonas delhiensis B-11400 [84]. Клубеньковые бактерии рода Rhizobium(Rhizobium lotus) были выделены в исследовательской лаборатории НИИСХ С-В им. Н.В. Рудницкого и предоставлены в лабораторию кафедры Микробиологии ВятГУ для дальнейшего изучения в рамках НИР «Симбиоз». В настоящий момент данный род бактерий находится на стадии депонирования в ВКПМ ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.
Стоит так же отметить, что непременным условием использования выше перечисленных микроорганизмов в составе биопрепарата для ремедиации почв, загрязненных углеводородами нефти in situ, является наличие технологий, обеспечивающих его производство в больших количествах. Глубинное культивирование микроорганизмов – основной этап технологии получения биопрепарата, от условий и режимов проведения которого во многом зависят его количественный и качественные характеристики. Оптимизация процесса культивирования должна быть направлена на достижение максимального выхода биомассы, характеризующейся деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти.
Необходимо так же отметить, что применение микробных препаратов является неоднозначным и сложным по результативности процессом, который зависит от многих природных факторов. Поэтому для утилизации нефтезагрязнений необходима разработка комплексных методов и технологий.
В итоге, на данный момент времени специалисты из данной области склоняется к единому мнению, что для полной деградации и утилизации нефтезагрязнений необходимо сочетать разнообразные механические и химические воздействия, а на конечном этапе проводить биологическую доочистку до экологически и санитарно безопасного уровня. Такие комплексные решения помогут обеспечить максимальную степень эффективности и безопасности для окружающей среды.
2 Выбор направления исследования
Нефть является самым распространенным источником топлива и энергии в мире и относится к наиболее опасным, токсичным загрязнителям биосферы. В настоящее время из-за несовершенств технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти, а так же из-за малой эффективности существующих методов ликвидации нефтезагрязнений ежегодно возрастает процент нефтезагрязненных почв. Попадание нефтепродуктов в почву вызывает сильные и частично необратимые повреждения биогеоценозов. При попадании нефти почва становится основным трофическим субстратом для углеводородокисляющих микроорганизмов. Другие виды микроорганизмов, растения и животные находятся в угнетенном состоянии, подавляется ферментативная активность почвы. Ежегодно в мире потери при нефтедобычи и транспортировки нефти составляют около 3% от общего объема добываемой нефти. Применяемые в настоящее время препараты для биоремедиации нефтезагрязненных земель являются молоэффективными и не обеспечивают восстановления почв в полном объеме. Вследствие чего появляется необходимость разработки и внедрения новых более эффективных методов и технологий утилизации углеводородов нефти. В связи с этим одним из перспективных направлений в области ремедиации почв от нефтепродуктов является разработка биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации.
Объектом исследования является штамм микроорганизмов Pseudomonas delhiensis B-11400 - деструктор углеводородов нефти, штамм клубеньковых бактерий рода Rhizobium, семена Лядвенца рогатого.
Целью настоящей работы являлась отработка условий и режимов культивирования и концентрирования биомассы штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 – деструктора углеводородов нефти и биомассы штамма клубеньковых бактерий рода Rhizobium, отработка основных принципов составления растительно-микробных ассоциаций, разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации.
Задачи исследования:
1.Теоретически изучить основную схему приготовления биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации.
2.Освоить процесс глубинного культивирования и концентрирования исследуемых микроорганизмов. Отработать схему инокуляции клеток исследуемых микроорганизмов на носитель.
3.Определить дозу внесения биопрепарата на единицу площади нефтезагрязненной почвы.
4.Определить степень деградации нефти в почве с помощью растительно-микробной ассоциации.
Использовались классические лабораторные микробиологические методы, а также статистические методы обработки экспериментальных данных.
3 Материалы и методы
3.1 Микроорганизмы, семена исследуемого растения
В качестве объекта для научного исследования была выбрана растительно-микробная ассоциация на основе иммобилизированных на семенах растений из семейства бобовые Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) микроорганизмов штамма деструкторов углеводородов нефти представитель рода Pseudomonas, а именно штамм Pseudomonas delhiensis B-11400, и штамма клубеньковых бактерий рода Rhizobium. Штамм Pseudomonas delhiensis B-11400 отличается наилучшей углеводородокисляющей активностью. Штамм был выделен и идентифицирован в 2013 году. Было проведено депонирование штамма и включение его в ВКПМ [84]. Бактерии рода Rhizobium (вид не определен) были выделены на базе научно-исследовательской лаборатории в НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого из клубеньков растения Лядвенца рогатого и переданы для дальнейшего изучения в лабораторию кафедры Микробиологии Вятского государственного университета. В качестве растения, используемого для составления растительно-микробной ассоциации, были взяты семена Лядвенеца рогатого (Lotus corniculatus) сорта «Солнышко». Штамм бактерий рода Rhizobium отличается положительным влиянием на рост вышеуказанного растения, что в итоге повышает эффективность деградации углеводородов нефти в окружающей среде.
Основные культурально-морфологические особенности штамма Pseudomonas delhiensis B-11400. При 27-29 оС через 48 ч на агаре Хоттингера формирует колонии округлые, выпуклые, блестящие прозрачные, с ровными краями, диаметром 2,0-2,5 мм, на агаре Эндо с лактозой и фуксинолом - бледно-розовые, под цвет среды колонии, что свидетельствует об отсутствии у них способности ферментировать лактозу, в бульоне Хоттингера - рост в виде равномерного помутнения бульона со слизистым осадком, микроскопия окрашенных по Граму мазков - крупные грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно под углом друг к другу или цепочками, в тесте Хью-Лейфсона бактерии штамма окисляют, но не ферментировают глюкозу. Цвет среды в пробирке с вазелиновым маслом не меняется, оставаясь бутылочно – зеленым [84].
3.2 Питательные среды, реактивы, расходные материалы
1. Агар-агар микробиологический;
2. Арабиноза;
3. Гидроксид натрия;
4. Гидролизат рыбокостной муки;
5. Гидрофосфат калия, ч.д.а. ;
6. Гидрофосфосфат натрия, х.ч. ;
7. Гидрохлорид, х.ч. ;
8. Глицерин;
9. Глюкоза;
10. Дигидрофосфат калия, х.ч. ;
11. Дизельное топливо;
12. Дистиллированная вода;
13. Дрожжевой автолизат;
14. Дрожжевой экстракт;
15. Желатин;
16. Карбонат натрия, х.ч. ;
17. Керосин;
18. Крахмал растворимый;
19. Лактоза;
20. Манноза;
21. Масло иммерсионное;
22. Нефть (Южно-Шапкинское месторождение) ;
23. Оксид алюминия;
24. Обезжиренное молоко;
25. Панкреатический гидролизат казеина;
26. Раствор бромтимоловогосинего;
27. Раствор генцианвиолета;
28. Раствор кристаллического фиолетового;
29. Раствор Люголя;
30. Раствор метиленового синего;
31. Раствор перекиси водорода;
32. Салицилат натрия;
33. Сахароза;
34. Спирт этиловый ректифицированный;
35. Сульфат железа пятиводный, ч. ;
36. Сульфат магния семиводный, х.ч. ;
37. Сульфат марганца однозамещенный, х.ч. ;
38. Сухой питательный агар;
39. Тиомочевина;
40. Углерод четыреххлористый;
41. Фуксин Пфейфера;
42. Хлорид аммония, х.ч. ;
43. Хлорид кальция, ч. ;
44. Хлорид натрия, ч.д.а.
В ходе проведения данной работы использовались отечественные реактивы, которые имеют квалификацию х.ч. и ч.д.а. Сырье, препараты и реактивы применяли для приготовления необходимых в работе растворов и питательных сред, которые по своей квалификации все основным отвечают требованиям действующих нормативных документов. Так же в проведенных исследованиях использовалась нефть из Южно - Шапкинского месторождения. В качестве сорбента естественного происхождения были применены семена Лядвенца рогатого сорта «Солнышко». В качестве среды для проверки нефтеокисляющей активности растительно-микробной ассоциации использовали дерновоподзолистую почву. Так же использовали пластиковые контейнеры под почву объемом 500 мл в количестве 14 штук.
В ходе выполнения экспериментальной части выпускной квалификационной работы магистра были использованы жидкие (ЖПС) и плотные (ППС) питательные среды (ПС), которые готовили в лабораторных условиях с использованием в качестве основных компонентов сухих коммерческих препаратов и реактивов в соответствии с прилагающимися к ним инструкциям и прописям.
В данной научной работ для культивирования микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 и штамма бактерий рода Rhizobium использовались ПС: КГКДА, МПА, 8Е, МДА, МПБ. Для исследования ферментативной активности бактерий использовали ПС: молоко с метиленовой синью, цветные среды Гисса с углеводами, мясо-пептонный желатин. Состав питательных сред представлен в таблицах 2 - 9.
Таблица 2 - Состав питательной среды КГКДА
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 Кислотный гидролизат казеина 10,000
2 Дрожжевой экстракт 17,500
3 NH4Cl 4,760
4 K2HPO4*3H2O 2,620
5 Глюкоза 20,000
6 MgSO4 *7H2O 0,614
7 MnSO4 *H2O 0,056
8 Дистиллированная вода 1000 мл
Таблица 3 - Состав питательной среды МПА
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 Питательный бульон, сухой 16,0
2 Пептон, сухой 20,0
3 Агар-агар бактериологический 20,0
4 Дистиллированная вода 1000 мл
Таблица 4 - Состав питательной среды 8Е
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 NH4Cl 0,2
2 KH2PO4 0,7
3 MgSO4 *7H2O 0,5
4 NaCl 0,8
5 Дистиллированная вода 1000 мл
При приготовлении среды 8Е в нее после розлива в чашки Петри вносили нефть из расчета 8 мл нефти на 500 мл ПС [106].
Таблица 5 - Состав питательной среды МДА
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 Дистиллированная вода 1000 мл
2 Маннит (сахароза) 10
3 K2HPO4 ∙ 3H2O 1,5
4 MgSO4 ∙ 7H2O 0,2
5 NaCl 0,1
6 Дрожжевой экстракт 1,0
7 Агар – агар (для плотной среды) 15
8 CaCO3 Следы
Таблица 6 – Состав питательной среды МПБ
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 Питательный бульон, сухой 20,0
2 Дистиллированная вода 1000 мл
Режим стерилизации для представленных ПС: автоклавирование при температуре 121ºС в течение 45 минут.
Таблица 7 - Состав питательной среды Гисса
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 Дистиллированная вода 1000 мл
2 Пептон 10, 3
3 NaCl 5,1
4 Агар–агар 3,8
5 1,6 %-ный раствор бромтимоловогосинего 0,1 мл
Один из 6 углеводов: лактоза, сахароза, глюкоза, арабиноза, крахмал растворимый, манноза – добавили в отдельные колбы с питательной основой из расчета по 1,25 г на 100 мл.
Таблица 8 – Состав питательной среды из молока с метиленовой синью
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 Обезжиренное молоко 1000 мл
2 1 %-ный раствор метиленовой сини 20 мл
3 10 %-ный раствор Na2CO3 Следы
Таблица 9 – Состав питательной среды мясо-пептонный желатин
№ п/п Наименование компонента Количество, г/л
1 МПБ 1000 мл
2 Желатин 150
3.3 Приборы и оборудование
Для проведения всех этапов экспериментальной части дипломного проекта на базе лаборатории кафедры микробиологии ВятГУ использовалось следующее оборудование:
Шейкер инкубатор ES-20;
Весы лабораторные OHAUS Discovery DV114C;
Стерилизатор паровой втоматический СПГА-100-1-НН;
Шкаф сухожаровый Sanyo Convection Oven MOV-212F;
Термостат TCO-1/80 СПУ (Россия);
Шкаф вытяжной 1ШВ – 2А–НЖ;
Биореактор LiFlus GX Bio-Tron Inc (Южная Корея);
Установка «Сартокон-мини»;
Аквадистиллятор DE – 10;
Микроскоп ЛОМО Микмед – 2;
Электроплитка «Искорка» (Россия) ГОСТ 14949-83Е;
АН-2 концентратомер;
Цифровой фотоаппарат;
Лиофилизационная установка FreeZone 12L LABCONCO;
Холодильник «INDESIT BIA 18 S» ;
рН-метр РН150МА;
Мешалка магнитная ММЗМ, ТУ 25-11-834-93;
Петля бактериологическая;
Чашки Петри с крышками, ГОСТ 25366 - 82Е;
Автоматические пипетки переменного объёма (0,002...0,01; 0,01…0,1; 0,1…1,0 см3) с наконечниками фирмы «Ленпипет», Россия;
Пипетки стеклянные объёмом 1,0; 5,0; 10,0, ГОСТ 2092 - 84;
Лабораторная посуда (цилиндры и колбы на 500-1000 мл), ГОСТ 1770-74Е.
3.4 Методы исследований
1) Изучение культурально-морфологических свойств штамма клубеньковых бактерий.
Для исследования свойств была приготовлена суспензия культуры клеток микроорганизма с помощью стандарта ОСО, которая высевалась в объеме 0,1 мл на МДА в чашках Петри. Культивирование проходило при температуре 28º С в течение 48 часов. Через 2 суток изучалась морфология колоний бактерий. При этом отмечались следующие свойства: форма, величина, характер края и поверхности, цвет, оптические свойства, консистенция. Исследование морфологии колоний осуществлялось невооруженным глазом, с помощью стереомикроскопа и лупы.
2) Приготовление фиксированного препарата
На обезжиренное предметное стекло, прокаленное над пламенем спиртовки, бактериологической петлей наносится микробный материал в каплю с физиологическим раствором. После чего микробная культура распределяется на поверхности предметного стеклышка тончайшим слоем. Далее мазок сушится естественным путем и фиксируется, методом проведения предметного стекла с микроорганизмами над пламенем горелки. Фиксация осуществляется таким образом, чтобы поверхность предметного стекла, на которую была нанесена культура, была обращена кверху. Фиксация нужна для того чтобы улучшить дальнейшую способность клеток микроорганизмов к окраске, так как живые клетки слабо воспринимают красители[59].
3) Окраска микроорганизмов
Окрашивание по Граму. Данный метод позволяет определить принадлежность клеток микроорганизмов к тому или иному роду и виду (грамположительные или грамотрицательные палочки или кокки) [60].
На стекло наносили краситель генцианвиолет на 2 мин. Затем - раствор Люголя на 2 мин и обесцвечивали спиртом, промывали дистиллированной водой. Наносили краситель фуксин, вновь на 2 мин и промывали дистиллированной водой. После окраски для удаления влаги стекло промокали фильтровальной бумагой. Мазок микроскопировали под иммерсионным маслом (объектив  90).
Окрашивание фуксином Пфейфера на выявление опоясанности бактерий. Это простой метод окрашивания, для которого готовили водный раствор фуксина из фенолового фуксина Циля (основной фуксин – 1 г, спирт этиловый 96%-ный – 10 мл, фенол кристаллический – 5 г, глицерин – несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл), разводя его в соотношении 1:9 дистиллированной водой [59].
4) Изучение ферментативной активности клубеньковых бактерий.
Выявление сахаролитической активности бактерий, т.е. способности расщеплять сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты или кислоты и газа. Для изучения используют среды Гисса, которые содержат тот или иной углевод и индикатор. Приготовленные стерильные питательные среды в пробирках по 5 мл с определенными углеводами засевали суточной культурой микроорганизмов с помощью бактериологической петли. Помещали в условия термостата на 48 часов при постоянной температуре 28ºС.
Под прямым действием кислоты, которая образовалась при расщеплении углевода, индикатор способен изменять окраску среды. Микробы, не способные к ферментации данного углевода, растут на этой среде, не изменяя ее окраски. О наличие образующегося газа можно судить по образованию пузырьков в плотных агаризованных средах или по скоплению его в стеклянном или пластиковом "поплавке" на жидких средах. В качестве таких "поплавков" используют узкие стеклянные или пластиковые трубочки с обращенным вверх запаянным концом, которые помещают в пробирки с питательными средами до процесса стерилизации.
Способность микроорганизмов к расщеплению белков (полипептидов), т.е., протеолитическая активность, изучается на полужидких средах с желатином. В данном случае использовали МПБ с добавлением желатина. После смешивания компонентов оставили набухнуть желатину 30-40 мин, далее растопили его на водяной бане, разлили в объеме 5 мл по нестерильным пробиркам и далее стерилизовали с помощью текучего пара в течение 60 мин. Дали остыть и бактериологической петлей по методу укола внесли клеточную культуру. Поставили в термостат при температуре 28º С на 48 часов. При росте на такой среде микроорганизмы, ферментирующие желатин разжижают среду, а бактерии, не обладающие протеолитической активностью, в процессе роста среду не изменяют [59].
Редуктазная проба с метиленовой синью на молоке. Обезжирили молоко на центрифуге в течение 10 мин с 10000 об/мин. Молоко без сливок подщелачивали 10%-нымкарбоксидом натрия и добавили 1%-ный раствор метиленового синего. Готовую темно-голубую питательную среду разлили по 5 мл по пробиркам, простерилизовали текучим паром 60 мин и засеяли бактериологической петлей суточную культуру клубеньковых бактерий. В случае наличия редуктазы у микроорганизмов наблюдается обесцвечивание индикатора [59].
5) Культивирование клеток в биореакторе производства BIOTRON
Получение посевного материала. Для глубинного культивирования получили посевной материал из лиофильно высушенного вида биодеструктора. Для этого в приготовленную среду МПБ, разлитую по колбам объемом 250 мл по 50 мл среды после автоклавирования при температуре 121º С в течение 45 мин внесли по 0,3 мл инокулят. Его получили из ампулы с лиофильно высушенной культурой, в которую добавили 1 мл физиологического раствора. Поставили в термостат при 28º С на 24 часа.
Культивирование на биореакторе. Для работы с биореактором прикрепили набор датчиков: резиновый уплотнитель для датчика пены, перистальтический насос, отдельно подготовили воздушные фильтры с силиконовыми трубками и обратный холодильник с колбой для защиты фильтра.
Приготовили в сосуде ферментера 2,5 л питательного бульона. Подготовили к стерилизации: на верхней крышке все концы силиконовых трубок (для перистальтических насосов, трубка для отбора проб) закрыли зажимами, чтобы предотвратить попадание влаги во время стерилизации, и бумагой; ватной пробкой и бумажным колпачком закрыли отверстие для внесения культуры и сосуд ферментера плотно затянули болтами верхней крышки. Концы воздушных фильтров обернули алюминиевой фольгой для предотвращения попадания влаги внутрь фильтра. Поставили в автоклав на 45 мин при температуре = 121°С.
После чего подключили ферментер к системе управления: поставили на подставку с электронагревателем, флакон с щелочью (NH4OH) посредством силиконовой трубки провели через перистальтический насос и соединили с биореактором для регулирования рН в ходе ферментации. Стерильный стеклянный электрод прикрепили в специальное отверстие, подключили теплообменник, датчик пены и электроконтактный термометр, подключили аэрацию и установили значение поступающего воздуха 1 л/мин.
Подключили биореактор к сети, включили воду для холодильника и теплообменника, включили аэрацию (1 л/мин). На экране установили необходимые значения : рН = 7,2 (диапазон роста при рН = 7,0 – 7,4)температура = 28°С, автоматическое добавление щелочи при изменение рН 2 капли через 20 сек.
Из подготовленных колб с посевным материалом с помощью пипетки стерильно внесли культуральную жидкость с клетками в ферментер биореактора. Культивирование продолжалось в течение 2 суток.
6) Получение концентрированной суспензии микроорганизмов. Полученную жидкую суспензию микроорганизмов после культивирования глубинным способом подвергли концентрированию при помощи системы «Сартокон-мини». Дезинфицирование системы путем 40-минутной циркуляции 7%-ного раствора перекиси водорода с последующим промыванием ионизированной водой. По завершению процесса культивирования к биореактору была подключена данная система. Суспензия микробных клеток с помощью действующего насоса поступала под давлением в систему и продавливалась через мембранные фильтры. Культура концентрировалась в биореакторе, а культуральная жидкость отделялась в приемную емкость.
7) Иммобилизация концентрированной биомассы на носителе.
Полученные концентраты микроорганизмов обоих штаммов смешивали в равных объемах и стабилизировали с помощью сахарозо-желатиновой среды (пропорция 3/2). После это производится процесс иммобилизации клеток на носителе с помощью смешения концентрата с семенами в соответствии с методикой. Далее обработанные семена подвергаются высушиванию в вытяжном шкафу в течение 20 минут, после чего оставляются при естественной аэрации до полного высыхания – получения сыпучего материала.
3.5 Методы статистической обработки экспериментальных
данных
Все результаты исследований экспериментальной части дипломного проекта обработаны с помощью статистических методов и представлены в виде средних арифметических значений. Значения определены с доверительным интервалом при уровне вероятности, равном 95%.
Данные, полученные в ходе экспериментального исследования, статистически обрабатывали с помощью основных методов вариационной статистики, при этом использовали параметрический критерий Стьюдента, также использовали метод корреляционного анализа. Обработку данных вели при помощи пакета программ вариационной статистики MS Excel 2007 непосредственно с использованием персонального компьютера (ПК).
4 Экспериментальные исследования
4.1 Оценка культуральных и морфологических свойств исследуемых микроорганизмов
Культурально-морфологические свойства микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 оценивались с помощью высева на плотную питательную среду МПА. Результаты данного исследования представлены в таблице 10. Внешний вид колоний микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 на питательной среде МПА представлен на рисунке 2.
Таблица 10 – Морфологическое описание колоний микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400
№ п/п Признак Характеристика
1 форма колоний округлая
2 оптические свойства непрозрачная, блестящая
3 цвет кремовый
4 поверхность гладкая
5 профиль выпуклый
6 край ровный
7 консистенция маслянистая

Рисунок 2 – Внешний вид колоний микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 на питательной среде МПА
Для определения морфологических характеристик микроорганизмов осуществляли окраску по Граму с дальнейшей микроскопией полученных мазков. В результате проведенных манипуляций были выявлены Грам «-» палочки длиной от 2,0 до 2,5 мм, расположенные одиночно или под углом друг к другу. Микроскопия микробов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 представлена на рисунке 3.
12915901270000
Рисунок 3 – Клетки микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400, х*1500
Клубеньковые бактерии р. Rhizobium были выделены в естественных условиях на территории Кировской области в 2015 году сотрудниками НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого и переданы для дальнейшего их изучения в составе растительно-микробной ассоциации для ремедиации нефтезагрязненных почв. В настоящее время данный род микроорганизмов находится на стадии идентификации в ВКПМ ГосНИИГенетика. Предположительное видовое название штамма, выявленное на основании изучения и определения с помощью определителя Берджи, Rhizobium lotus. Предположительное название штамма Rhizobium lotus RL-5.
Культурально-морфологические характеристики микроорганизма штамма оценивали на плотной питательной среде на основе дрожжевого автолизата. Результаты данного исследования представлены в таблице 19.
Таблица 11 – Морфологическое описание колоний микроорганизмов штамма Rhizobium lotus RL-5
№ п/п Признак Характеристика
1 форма колоний неопределенная
2 оптические свойства не прозрачные, блестящие
3 цвет белые, молочные
4 поверхность гладкая
5 профиль выпуклые
6 край ровный
7 консистенция слизистые
Внешний вид колоний клубеньковых бактерий р. Rhizobium представлен на рисунке 4.
1320165-41529000
Рисунок 4 – Внешний вид колоний клубеньковых бактерий р. Rhizobium на питательной среде МДА
1186815210375500Морфологические характеристики клеток изучаемого микроорганизма устанавливали методом окраски по Граму с последующим микроскопированием. В результате были определены грамотрицательные короткие палочки с закругленными концами, при окраске фуксином наблюдается опоясанность клеток, что может говорить о наличии включений и разном прокрашивании клеточных компонентов. Внешний вид клеток представлен на рисунке 5, 6.
Рисунок 5 – Клетки клубеньковых бактерий р. Rhizobium , окраска по Граму, х1500
1615440-15240
Рисунок 6 – Клетки клубеньковых бактерий рода Rhizobium, окраска фуксином Пфейфера, х1500
В ходе выращивания данного рода микроорганизмов на жидкой питательной среде было выявлено равномерное помутнение, то есть рост равномерный. В следствие это позволило говорить о том, что исследуемый штамм микроорганизмов является облигатным аэробом.
Так же микроорганизмы подвергались изучению биохимических свойств, в результате было установлено, что данный штамм не обладает протеолитической активностью. Протеолитическую активность проверяли на питательном бульоне с желатином. Засевали суточную культуру клубеньковых бактерий и культивировали при температуре 28º С в течение 48 часов. Разложения не наблюдалось. Штамм оксидазоположителен, каталазоотрицателен.
Для определения активности ферментов по отношению к углеводам готовили среды Гисса с наличием в составе лактозы, сахарозы, крахмала, арабинозы, маннозы, глюкозы. В качестве контроля использовали питательную среду без добавления углеводов. Все пробирки засеяли суточной культурой ризобий бактериологической петлей. Культивировали при температуре 28º С в течение 48 часов.
В результате были обнаружены сахаролитические свойства по отношению к лактозе, сахарозе и растворимому крахмалу, что просматривается изменением цвета индикатора в синий цвет на поверхности питательной сред Гисса и в случае с сахарозой осветление среды.
4.2 Интенсификация фиторемедиационных процессов в почве загрязненной нефтью, с применением симбиотических бактерий рода Rhizobium в качестве стимулятора роста растения, а также микроорганизма – нефтедеструктора
4.2.1 Получение концентрированной суспензии микроорганизмов
4.2.1.1 Оптимизация условий глубинного периодического культивирования исследуемых микроорганизмов Pseudomonas и р. Rhizobium
Важным этапом в процессе получения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации является стадия получения посевного материала и дальнейшее глубинное культивирование микроорганизмов.
Посевной материал готовили непосредственно перед глубинным культивированием из чистой обновленной на агаризованной среде исходной культуры клеток с последующим выращиванием на жидкой питательной среде в шейкере.
Исходная форма посевных культур исследуемых микроорганизмов была в виде эппендорфов с замороженными клетками. Обновление культур осуществляли посредством высева на чашки с ППС. Далее в приготовленные жидкие среды, разлитые в колбы объемом 250 мл по 50 мл вносили обновленные инокуляты. Колбы ставили в шейкер-инкубатор на 24 часа при 28º С при оборотах качалки 180 об/мин.
В рамках экспериментальной части выпускной квалификационоой работы магистра глубинное периодическое культивирование проводили в условиях лаборатории экспериментальной биотехнологии кафедры микробиологии ВятГУ в емкостном аппарате - автоклавируемом биореакторе (ферментере) типа LiFlus GX производства Bio-Tron Inc, представленного на рисунке 7. За основу при выборе параметров аппаратного культивирования использовали результаты выращивания исследуемых микроорганизмов в жидкой среде на шейкер – инкубаторе в колбах.

Рисунок 7 - Автоклавируемый биореактор типа LiFlus GX производства Bio-Tron Inc
В процессе приготовления биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации для ликвидации почвенных загрязнений нефтью и нефтепродуктами важным является приготовление микробного компонента в данном случае это консорциум двух штаммов микроорганизмов Pseudomonas delhiensis B-11400 и Rhizobium lotus RL-5. И поэтому здесь имеется необходимость учитывать определенные различия физиолого-биохимических свойств, таких как термотолерантность, осмофильность, оптимальные для роста значения рН, способность включать в свои метаболические процессы разные классы углеводородов, минеральных веществ, взаимное влияние образовавшихся в процессе жизнедеятельности метаболитов.
В ходе исследования было выявлены совпадающие моменты: оптимальная температура роста (28º С) и значения рН: для клеток ризобий 6,8 – 7,2, для псевдомонад 7,0 – 7,4, оба штамма аэробы.
Таким образом, глубинное периодическое культивирование клубеньковых бактерий провели по аналогичным параметрам наработки биомассы нефтедеструктора.
В ранее проведенных исследованиях в рамках темы НИР «Разработка экспериментального биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов, предназначенного для биоремедиации загрязненных нефтепродуктами почв Нечерноземной зоны России» был выделен штамм микроорганизмов Pseudomonas delhiensis B-11400 из почв, хронически загрязненных нефтепродуктами. Была выявлена его нефтеокисляющая активность. Данный штамм был подвергнут заморозке при ультранизкой температуре, а так же лиофильной сушке и помещен на временное хранение в музей лаборатории кафедры микробиологии ВятГУ. Так же был подобран оптимальный состав питательной среды и условия глубинного культивирования штамма. Кроме того было выявлено положительное влияние раствора салицилата натрия на рост штамма микроорганизмов Pseudomonas delhiensis B-11400 в условиях периодического глубинного культивирования, который в дальнейшем стал использоваться в качестве индуктора роста для данного штамма.
Глубинное культивирование проводили при следующих режимах: температура 28˚С; скорость перемешивания 450 об/мин; кислотность среды – рН 7,0-7,4 (поддерживали автоматически с помощью добавления в среду 12%-ного раствора аммиака); аэрация воздухом – 3 л/мин в первые 4 часа роста, а затем – 6 л/мин. В качестве источника углерода использовали глюкозу, а в качестве ростстимулирующей добавки - салицилат натрия. Салицилат натрия вносили в биореактор через 4 часа после начала культивирования. Культивирование вели в течение 24 часов. Через каждые 1,5 часа проводили отбор проб из биореактора для определения биологической концентрации микроорганизмов. Результаты культивирования представлены в таблице 12.
Таблица 12 – Характеристика микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 в динамике глубинного периодического культивирования
Время выращивания, ч Содержание клеток в культуральной жидкости, млрд. ж.м.кл/мл
0,00 0,50
3,00 5,21
4,50 10,36
6,00 12,27
7,50 13,50
9,00 14,00
10,50 14,00
22,00 14,00
24,00 12,40
На основании данных таблицы 12 построен график зависимости количества образовавшейся биомассы клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 в динамике культивирования, представленный на рисунке 8.

Рисунок 8 – График зависимости роста биомассы клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 от времени культивирования
Таблица 13 – Характеристика культуры штамма Pseudomonas delhiensis B-11400, выращенной в биореакторе LiFlus GX
Наименование
штамма Показатель концентрации водородных ионов, ед. рН Количество микробной массы, млрд.м.кл/мл, определенное по… Выход биомассы с биореактора, дм3
ОК БК Pseudomonas delhiensis B-11400 6,80±0,50 16,12±1,06 12,40±0,80 2,50±0,30
Было подтверждено, что экспериментально выбранные режимы культивирования в условиях биореакторе LiFlus GX полностью обеспечивают получение микробной культуры с типичными по морфологии клетками штамма Pseudomonas delhiensis B-11400, в количествах, достаточных для ее использования в дальнейшей работе на этапах приготовления биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, а, именно в процессе концентрирования.
Посевной материал готовили из чистой культуры ризобий в 2 колбах на 250 мл с 20 мл жидкой питательной среды МДА в условиях шуттелирования в шейкер-инкубаторе при 180 об/мин в течение 48 часов в условиях 28̊ С.
Для выбора оптимальных параметров глубинного культивирования в биореакторе следили за ростом клеточной культуры в колбах. Вычисляли зависимость оптической концентрации от времени культивирования, которую определяли на фотоэлектроколориметре каждые 30 мин после начала посева клеточной суспензии. В результате в условиях шейкер-инкубатора кривая роста микроорганизмов выходит на стационарную фазу на 2 сутки культивирования.
Глубинное культивирование ризобий проводили также в автоклавируемом биореакторе типа LiFlus GX производства Bio-TronInc на жидкой питательной среде МДА при режиме: температура 28º С; скорость перемешивания 450 об/мин; кислотность среды (рН) 6,8 – 7,2 (поддерживали автоматически с помощью добавления в среду 12%-ного раствора аммиака); аэрация воздухом – 3 л/мин.
Посевная доза составляла 30 % от объема питательной среды с концентрацией в 1 мл 0,5 млрд. кл. Культивирование вели в течение 48 часов. Через каждые 2 часа производили отбор проб для определения оптической и биологической концентраций.
Результаты культивирования представлены в таблице 14.
Таблица 14 – Характеристика роста бактерий рода Rizobium в динамике глубинного периодического культивирования
Время выращивания, ч Содержание клеток в культуральной жидкости, млрд. ж.м.кл/мл
0,00 0,25
6,00 0,60
12,00 1,20
18,00 3,60
24,00 7,20
30,00 10,40
36,00 13,40
42,00 15,20
48,00 14,60
Для наглядности результаты зависимости изменения оптической плотности от времени приведены на рисунке 9.

Рисунок 9 – График зависимости роста биомассы клеток штамма Rhizobium lotus RL-5 от времени культивирования
\
Таблица 15 – Характеристика культуры штамма Rhizobium lotus RL-5, выращенной в биореакторе LiFlus GX
Наименование
штамма Показатель концентрации водородных ионов, ед. рН Количество микробной массы, млрд.м.кл/мл, определенное по… Выход биомассы с биореактора, дм3
ОК БК Rhizobium lotus RL-5 6,53±0,60 20,30±1,09 15,20±0,70 2,50±0,52
Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что при соблюдении одинаковых условиях периодического глубинного культивирования исследуемых микроорганизмов Pseudomonas delhiensis B-11400 и Rhizobium lotus RL-5 наблюдается достаточная для получения образца биотехнологического препарата биомасса клеток микроорганизмов.
4.2.1.2 Отработка условий концентрирования исследуемых микроорганизмов р. Pseudomonas и р. Rhizobium
Для отделения микробных клеток от культуральной жидкости биотехнологии используют различные методы разделения, направленные на получение очищенного концентрированного продукта.
На промышленном производстве переработку культуральной жидкости ведут сепарацией. Так же для отделения мелкодисперсного клеточного материала возможно использование фильтрации. К другим методам разделения веществ относят центрифугирование, осаждение, экстракцию, ионообмен, кристаллизацию.
Одним из наиболее перспективных методов является метод мембранной фильтрации. Для выполнения данного этапа исследовательской части дипломного проекта использовали именно этот метод. Мембранное концентрирование осуществляли при помощи установки «Сартокон-мини», представленой на рисунке 10.

Рисунок 10 – Установке «Сартокон-мини»
Ниже приведена основная характеристика установки «Сартокон-мини», используемой для выполнения стадии концентрирования.
«Сартокон - мини» – это модульная ультра- и микрофильтрационная система, которая уже хорошо зарекомендовала себя при выращивании и промывке клеточных культур. На рисунке 11 представлены основные составляющие части данной установки.
305308097790003787140107316004251960-1676402
2

1604010129540
3962402133601
1

6819901873250045478701574803
3

36728401397100
\
Рисунок 11 – Установка «Сартокон - мини». 1 - опорная рама, 2- пластины для ретентата и пермеата с зажимными элементами, 3 – арматура
Опорная рама имеет прямоугольную форму с двумя вертикальными пластинами и направляющими штангами и образует опорную раму зажимного устройства.
Пластины для ретентата и пермеата с зажимными элементами установлены вертикально. Пластина для ретентата крепится к передней опорной пластине и имеет два затяжных болта. Параллельно к болтам по опорной раме проходят обе направляющие штанги, по которым пластина для пермеата движется параллельно пластине для ретентата внутри опорной рамы вперед и назад и на которых она фиксируется с помощью затяжных элементов. Между пластинами вставляются от 1 до 5 модулей. С помощью затяжных болтов и динамометрического ключа модули крепятся между пластинами, что образуется компактный элемент. В пластины вмонтирована система для направления жидкости. От наконечников для шлангов, находящихся на боковых поверхностях пластин, жидкость в пластинах направляется к расположенным в два ряда отверстиям на внутренних сторонах пластин. Эти отверстия совпадают с соответствующими входными и выпускными отверстиями модулей.
Арматура. Два стальных манометра на пластине для ретентата регулируют и контролируют давление на стороне ретентата.
Технические характеристики системы «Сартокон - мини»:
материал: инструментальная сталь;
вес: около 10 кг;
высота: 160 мм;
длина: 280 мм;
ширина: 190 мм;
подсоединения: наконечники шлангов с накидными гайками для шлангов ф8 мм;
заданный затяжной момент: 50 нм;
максимальное рабочее давление: 4 бара при 20 °С;
минимальный рабочий объем: 200 мл (в сочетании с мембранным насосом шланг ф8 мм [93].
С помощью системы «Сартокон-мини» была получена концентрированная биомасса микробных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400, отделенная от культуральной жидкости. Для этого по завершению процесса культивирования к биореактору была подключена система «Сартокон-мини», представленная на рисунке 12.

Рисунок 12 - Система подключения биореактора к установке «Сартокон-мини»
Принцип работы смонтированной системы заключался в следующем. С помощью насоса суспензия микробных клеток поступала под давлением в установку и продавливалась через мембранные фильтры. На выходе были получены отдельно концентрат микробных клеток и отдельно культуральная жидкость.
р. Pseudomonas. Концентрирование проводили до 1 дм3 при Рвх = 3,1 bar, Р вых = 2,5 bar, при скорости потока v = 3,6 м3/ч. Получили 1 дм3 концентрированной суспензии штамма Pseudomonas delhiensis B-11400, которая имела внешний вид, представленный на рисунке 13 и характеристику, представленную в таблице 16.

Рисунок 10 – Микробный концентрат клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400
Таблица 16 – Характеристика микробного концентрата штамма Pseudomonas delhiensis B-11400
Содержание клеток бактерий (млрд.м.кл/мл) определенное по… рН Количество …, дм3
ОК БК Культураль-
ной среды Культураль-
ной жидкости Концентри-рованной суспензии
64,1 ±3,1
49,7 ±1,5
6,8 3,0 ±0,3
2,0 ±0,4
1,0 ±0,1
Установлено, что отработанные условия и режимы концентрирования на установке «Сартокон-мини» обеспечивают получение микробного концентрата типичных по морфологии клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 в количестве 1дм3 .
р.Rhizobium. При изучении морфологии клеток с помощью окраски по Граму выявлено, что бактерии имеют форму коротких небольших закругленных по концам грамотрицательных палочек. Поэтому, рациональнее всего использовать установку мембранного концентрирования «Сартакон-мини» для разделения клеток от питательной среды и получения целевого продукта.
«Сартокон - мини» – это модульная ультра- и микрофильтрационная система, которая уже хорошо зарекомендовала себя при выращивании и промывке клеточных культур.
Принцип работы системы заключался в следующем: с помощью насоса суспензия микробных клеток поступает под давлением в установку и продавливалась через мембранные фильтры, а на выходе получают отдельно концентрат микробных клеток и отдельно культуральная жидкость.
Концентрирование проводили до 1 дм3 при Рвх = 3,1 bar, Р вых = 2,5bar, при скорости потока v = 3,6 м3/ч. Получили 1 дм3 концентрированной суспензии клеток клубеньковых бактерий (рисунок 14) с характеристикой, приведенной в таблице 17. Данного объема хватит для получения образца биологического препарата.
152971599695
Рисунок 14 – Микробный концентрат клеток клубеньковых бактерий
Таблица 17 – Характеристика микробного концентрата клеток штамма Rhizobium lotus RL-5
Содержание клеток бактерий (млрд.м.кл/мл) определенное по… рН Количество …, дм3
ОК БК Культураль-ной среды Культураль-ной жидкости Концентри-рованной суспензии
62,4±2,9 48,81±1,3 7,2 3,0 ±0,3 2 ±0,4 1,0 ±0,1
4.3 Разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, предназначенного для ремедиации нефтезагрязненных почв
4.3.1 Предпосевная обработка культурами микроорганизмов семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus)
На предварительном этапе на базе лаборатории в НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого были получены азотфиксирующие симбиотические бактерии рода Rhizobium из клубеньков Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Данные микроорганизмы способны образовывать симбиотические отношения с бобовыми культурами, в частности Лядвенцом рогатым.
Лядвенец рогатый (Lotus corniculatus) это травянистое многолетнее растение из семейства бобовые (Fabaceae). Оно может произрастать на очень тяжелых, в отношении присутствия поллютантов, и бедных почвах, и одновременно являться фактором, способствующим рекультивации, разрыхляя почву на глубину до 1,5 м, тем самым обогащая ее важными минеральными соединениями.
Отличительной характерной чертой растений из семейства бобовые является их способность к фиксации молекулярного азота из атмосферы, это становится возможным благодаря их симбиотическим связям с клубеньковыми бактериями. Растения способны самостоятельно усваивать лишь до 30% азота, в то время как консорциум растение-бактерии может повышать потребление азота в более чем 2 раза.
В качестве активного нефтеокисляющего агента будет использоваться штамм микроорганизмов Pseudomonas delhiensis B-11400 – деструктор углеводородов нефти, который так же способен стимулировать рост ризобий и опытного растения в целом.
На данном этапе экспериментальной части работы осуществляли предпосевную обработку концентрированными суспензиями микроорганизмов семена опытного растения Лядвенца рогатого.
Использование жидких концентрированных биопрепаратов способствует максимально-равномерному нанесение бактерий на поверхность семян. Это позволяет на первом этапе после посева быстрое вживление бактерий в корень растения, по сравнению с сухими препаратами, а так перед процессом фиторемедиации, пока растение не проросло, активизировать процесс биоремедиации с помощью бактерий-нефтедеструкторов. Преимуществом жидкой формы препарата является также удобство его нанесения на семена.
С помощью аналитических лабораторных весов делали три навески семян Лядвенца рогатого сорта «Солнышко» массой 2 г, представленного на рисунке 15.

Рисунок 15 – Семена Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus), сорт «Солнышко»
Опыт проводили с тремя образцами: концентрированная суспензия микроорганизмов-нефтедеструкторов, концентрированная суспензия клубеньковых бактерий рода Rhizobium, смешенная суспензия исследуемых бактерий. В качестве стабилизирующей среды для концентрированных суспензий использовали протекторную защитную сахарозожелатиновую среду (10 % сахарозы + 1% желатина). Раствор на основе сахарозы с желатином является внеклеточной защитной средой, обеспечивающей более высокую жизнеспособность клеток при дальнейшем высушивании. Семена пересыпали в 3 мерных стакана соответствующего объема. В первый образец с семенами, пипеткой, добавляли 1 мл жидкой концентрированной суспензии бактерий Pseudomonas delhiensis B-11400, во второй стакан – 1 мл клубеньковых бактерий рода Rhizobium, а в третий – по 0,5 мл смешанной суспензии. Иммобилизацию проводили путем перемешивания на шейкере в течение 30 минут при 120 об/мин. Затем для удаления избыточного количества микробов с носителя проводили досушивание на фильтровальной бумаге в условиях естественной воздушной тяги.
Общая характеристика биопрепарата представлена в таблице 18
Таблица 18 – Общая характеристика биопрепарата
Носитель Содержание жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий рода Rhizobium, млрд.ж.м.кл/г Содержание жизнеспособных клеток нефтедеструктора Pseudomonas delhiensis B-11400, млрд.ж.м.кл/г
Семена Лядвенца рогатого (1г) 5,9±1,5 9,3±1,1
Таким образом, готовый экспериментальный образец биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации представляет собой сухую неоднородную массу, состоящую из живых микробных клеток штамма-нефтедеструктора Pseudomonas delhiensis B-11400 и клубеньковых бактерий рода Rhizobiumв соотношении 1:1 в количестве не менее 6 млрд. микробных клеток в 1 г, иммобилизованных на носителе естественного происхождения семенах бобового растения Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Образец представлен на рисунке 16.
Рисунок 16 – Образец готовой форма биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации для ремедиации почв, загрязненных нефтепродуктами
4.3.2 Общее влияние нефтяного загрязнения на рост и развитие микроорганизмов и используемых растений
Для проведения исследований по интенсификации процесса нефтедеструкции использовали дерново-подзолистую почву, помещенную в пластиковые кюветы. Подготовленные пластмассовые кюветы объемом 500 мл и общей площадью 128,3 см2 засыпали почвой. Количество вносимых семян на одну кювету (1 опытный образец) рассчитывали исходя из общепринятых данных – 10 кг семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) на 1 га почвы, соответственно, масса необходимых на один опыт составила – 0,1 г (от 15-35 семян).
В каждый опытный образец почвы, кроме первого и четвертого, вносили нефть в количестве 1%, 3%, 5% от общего объема используемой культуры клеток микроорганизма – 1 мл, с учетом погрешности (вносили при помощи дозатора с наконечником на объем = 1мл) ~0,8 мл. Тщательно перемешивали, распределяя нефть по всей почве. Следующим этапом вносили семена в подготовленные кюветы с почвой, на глубину не более 1см. Таким образом, получилось 7 опытных образцов, представленных в таблице 19.
Таблица19 – опытные образцы почвы
№ опытного образца Составляющие компоненты Краткое обозначение
1 №1 – Почва (П)
2 №4 – Почва+ Семена (П)+ (С)
3 №2 – Почва +Нефть (П)+ (Н)
4 №3 – Почва +Нефть +Семена (П)+ (Н)+ (С)
5 №5 – Почва+Семена /Rs + Нефть (П)+ (C/Rh)+ (Н)
6 №6 – Почва +Семена /Ps+Нефть (П)+ (C/Ps)+ (Н)
7 №7 – Почва +Семена /Rh/Ps+ Нефть (П)+ (C/Rh/Ps)+ (Н)
После того как внесли все необходимые компоненты, почву увлажняли водой. Опыт проводили в трех повторностях. Эксперимент проводили в условиях климатической камеры, представлена на рисунке 17, в которой поддерживался на постоянном уровне световой период – 18 часов, влажность – 80%, рН – 6.8-7.2, температура –25˚С, аэрация. Продолжительность опыта составила 10 суток. Контрольные измерения на выявление роста семян осуществляли каждые 24 часа.
1186815290195
Рисунок 17 – Климатическая камера
На вторые сутки после посева в опытных образцах №№3, 5-7 визуально наблюдали всхожесть семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) стала - из семени начал выбиваться зародышевый листок. Визуальная всхожесть семян представлена на рисунке 18.
1729105-575945
Рисунок 18 – Всхожесть семян на второй день эксперимента
Числовые показатели всхожести семян представлены в таблице 20.
Таблица 20 – Всхожесть семян на вторые сутки
№ опытного образца Компонентный состав опыта Рост семян
1 П -
2 П + С +
3 П + Н -
4 П + Н+С -
5 П + С/Rh + Н -
6 П + С/Ps + Н +
7 П + С/Rh/Ps + Н +
Из приведенных данных делали предположения о влиянии клеток микроорганизмов на прорастание семян. В опытном образце №5 отсутствует видимый рост, это может свидетельствовать о не включении ризобий в симбиотические отношения с семенами, вследствие влияния различных факторов, на данный момент времени, либо рост был мал – не заметен при визуальном осмотре.
На 3-4 сутки рост наблюдали во всех опытных образцах, где были посеяны семена. Длина проростков в среднем до 5 мм над поверхностью почвы. Наиболее активный рост был замечен в опыте №2 (П+С, без добавления нефти, семена не обработанные бактериями). Соответственно, по уменьшению высоты ростов: №2, №7, №6, №5, №4. Заметили, что в опыте №5 (обработанные клубеньковыми бактериями семена) рост присутствует, но уступает по активности другим. Семена в образце №4 (П+С+Н) проявляют самую низкую активность в отношении роста. Количество проростков во всех опытных образцах варьируется от 10-15. Рост семян наглядно показан на рисунке 19.
-381066675
Рисунок 19 – Прирост наземной части на 4 день эксперимента
Показатели роста семян на 7 день представлен в таблице 21.
Таблица 21 – Рост семян на 7 сутки экспериментального исследования
№ опыта Компонентный состав опыта Средняя высота ростков, см Визуальные характеристики роста Количество
ростков
+/- листочки
Тонкий
/толстый стебель 1 П - - -
2 П+С 1,5-3,0 + Толстый 25
3 П+Н - - -
4 П+С+Н 1,0-2,0 +/- Тонкий 17
5 П+С/Rh+Н 1,0-2,5 +/- Толстый 21
6 П+С/Ps+Н 1,0-2,5 +/- Толстый 20
7 П+С/Rh/Ps+Н 1,0-3,0 + Толстый 25
В опытах №№2, 5-7: наблюдали утолщение стебля, большинство ростков распустили листочки, высота побега варьируется в одном диапазоне – от 1,0 до 3,0 см. Опыт №3, где стебли заметно тоньше и количество ростков уступает остальным значениям, объясняется тем, что семена не были обработаны ни одной культурой бактерий, но содержали в почве нефть. По истечению 7 дней опыта, исследуя полученные данные, делали вывод о влиянии симбиоза бактерий на рост растения. Таким образом, внесение бактерий Rhizobium lotus и Pseudomonas delhiensis B-11400 положительно влияет на растения, ускоряя процессы роста, и можно предположить об отсутствии антагонизма между данными бактериями одной высоты = 4 см. Различие было в количестве проростков на один опыт, № 4 – 35 растений, в то время остальные опыты имели границы роста 25-27, что соответствует компонентному составу. На рисунке 20 продемонстрирован рост семян на данный момент времени.

1176655-423545
Рисунок 20– 9 сутки экспериментального исследования
Окончательный количественный подсчет растений производили на 10 сутки эксперимента, измерили высоту ростков, также определили массу растений на лабораторных аналитических весах, длину корневой и надземной части. Результаты измерений приведены в таблице 22.
Таблица 22 – Контрольные показатели роста семян на 10 сутки эксперимента
№ опыта Компонентный состав опыта Количество ростков
Средняя высота ростков, см Масса растений,
г
Длина корневой части,
см
1 П - - - -
2 П + С 36 3,5 760 1,5-3,5
3 П + Н - - - -
4 П + С+Н 20 2,5 375 1-2,5
5 П + С/Rh + Н 32 3,2 480 1-2,5
6 П + С/Ps + Н 30 3 465 0,5-2,5
7 П + С/Rh/Ps + Н 38 4,0 782 1-3
Рост вегетативной массы растений от степени загрязнения почвы показан в таблице 4.
Таблица 23 – Зависимость роста вегетативной массы растений от степени загрязнения почвы
№ пробы Зависимость роста вегетативной массы растений от степени загрязнения НП…, г
1% 3% 5% Контроль (П+С)
3 0,08±0,20 0,03±0,12 0,01±0,30 2,50±0,21
4 0,50±0,30 0,30±0,02 0,10±0,04 5 1,70±0,25 1,40±0,70 0,80±0,01 6 1,20±0,32 0,80±0,40 0,40±0,03 7 2,30±0,60 1,80±0,31 1,20±0,20 На основании полученных результатов, можно сделать вывод, что растительно-микробная ассоциация (опытный образец №7), включающая микроорганизмы Rhizobium lotus и Pseudomonas delhiensis B-11400 более эффективно произрастает на нефтезагрязненной почве. Это может объясняться тем, что нефтеокисляющие бактерии способствовали более эффективному процессу азотфиксации клубеньковых бактерий за счет мобилизации труднодоступных соединений, а также ускоряли процесс накопления биомассы растением. Микроорганизмы рода Rhizobium в свою очередь непосредственно взаимодействовали с растением, стимулируя его питание и поступление веществ, главным из которых является азот.
4.4 Оценка нефтеокисляющей активности растительно-микробной ассоциации в процессе применения на нефтезагрязненной почве
Нефтеокисляющую активность растительно-микробной ассоциации оценивали методом определения остаточной концентрации нефтепродукта в среде (почве). Измерения проводили с помощью прибора АН-2 (анализатор нефти) согласно прилагаемой к данному прибору методике АИП 2 840.056.1 [133-134].
Для того чтобы приступить к измерению содержания углеводородов нефти в пробах почвы, необходимо подготовить чистую посуду и провести градуировку прибора для работы. Необходимую в работе посуду мыли моющими средствами, промывали водопроводной водой, ополаскивали дистиллированной водой, сушили. Затем промывали посуду экстрагентом, четыреххлористым углеродом, вновь сушили.
Проводили проверку чистоты экстрагента (CCl4) в концентратомере, который входит в состав АН-2. Кнопкой «диапазон» устанавливали диапазон измерений 100 мг/л. Пустую кювету помещали в кюветный отсек и кнопкой «ноль» устанавливали нулевое показание. Кювету ополаскивали и заполняли проверяемым экстрагентом (CCl4), помещали в кюветный отсек. Установившееся на цифровом табло показание не должно превышать 35 мг/л, для CCl4. Если число больше 35, то проводится дополнительная очистка экстрагента (очищают, промывая дистиллированной водой в специальных экстракторах при соотношении объемов экстрагента и воды 4:1).
Подготовка концентратометра АН-2 к работе и выполнение измерений производили в соответствии с руководством по эксплуатации АИП 2.840.056 РЭ. Прибор включали и прогревали в течение 30 минут, устанавливали кнопкой «диапазон» диапазон измерения 100 мг/л. Проводили градуировку, в кювету после трехкратного ополаскивания заливали CCl4, помещали в кюветный отсек, кнопкой «ноль» устанавливали устойчивое нулевое значение. Далее кювету вынимали, выливали из нее экстрагент, ополаскивали трехкратно раствором НП 100 мг/л, заполняли им кювету и ставили в отсек. Показания прибора должны быть в пределах 100 мг/л, с погрешностью 2 мг/л. Если показание на табло выходит из допустимого значения, то кнопкой «калибр» ставили нам необходимое значение 100,0. Кювету вынимали, промывали. Показания цифрового табло прибора записывали при отсутствии кюветы, оно являлось контрольным значением условного нуля и равнялось -27,5 мг/л.
Для исследования образцов почвы на содержание остаточной концентрации нефтепродукта, из каждого опыта отбирали примерно 50 г почвы. Крупные механические включения (камни, растительные остатки) удаляли пинцетом, высушивали. Для получения однородной массы образцы растирали в фарфоровой ступке при помощи пестика, просеивали через сито (диаметр отверстий 1 мм). На лабораторных аналитических весах делали навески почвенных образцов, которые в дальнейшем были подвергнуты исследованию.
Массу навески определяли исходя из содержания нефти на кг почвы, которую вносили перед началом опыта (1мл). Содержание нефти в почве, исходя из математических расчетов, составило 9800 мг/кг, масса навески будет равна 0,2 г.
Экстракция НП из проб почвы проводится следующим образом. Две параллельные навески почвы, помещали в два стакана экстрактора, заливали в них при помощи мерного цилиндра по 10 мл CCl4 и герметично закрывали винтовыми крышками. Стаканы устанавливали в экстрактор и приводили при помощи стартовой кнопки в движение (начинали вращаться). Спустя 60 минут экстракция заканчивалась, вращение прекращалось, и стаканы снимали. Отвинчивали крышки, давали отстояться 10 минут, необходимо для осаждения частиц почвы в растворе, и переносили при помощи автоматической пипетки с наконечником 1 мл, в подготовленную заранее пробирку при помощи воронки и бумажного фильтра, через который пропускали порядка 6 мл, после полученный элюат герметично закрывали крышкой.
На концентратомере АН-2 устанавливали диапазон измерения 100 мг/л. Кювету ополаскивали и заполняли очищенным элюатом, помещали в кюветный отсек, фиксировали значение массовой концентрации нефтепродуктов в элюате. Если результат измерений превышал верхний предел установленного диапазона более чем на 25%, элюат разбавляли экстрагентом. Измерение завершали при попадании значения в диапазон, элюат выливали в соответствующий слив, кювету промывали трехкратно. Последующие исследования образцов почв проводили аналогичным образом.
Полученные в процессе измерений образцов почв растворы элюата (№1-№7) представлены на рисунке 21.
253365107315Рисунок 21 – Очищенный раствор НП от полярных соединений (элюат)
Полученные результаты, массовую концентрацию НП в анализируемой пробе почвы, рассчитывали по формуле:

где Хi – массовая концентрация НП в пробе почвы (мг/кг),
Сi– концентрация НП в элюате, считанная с цифрового табло концентратомера (мг/л),
V– объем экстрагента (мл),
m – масса навески анализируемой пробы (г)
За результат измерений принимали среднее арифметическое значение трех паралельных определений, предел расхождения между которыми не превышал допустимого (19 мг/л). Расчеты полученных результатов в ходе работы с образцами почв представлены в таблице 5.
Таблица 24 – Расчет массовой концентрации НП в почве
№ опытного образца Остаточная концентрация нефтепродукта при загрязнении пробы почвы 1%, мг/кг
3 2736,3±2,0
4 7874,4±3,5
5 6361,4±4,1
6 4208,3±3,8
7 9781,5±4,7
Из представленных данных отчетливо видно, что использование ассоциации микроорганизмов на основе ризобий и псевдомонад уменьшает концентрацию нефти в почве в 3,65 раза, что соответствует степени ее деструкции в 76%, что и является стимулирующим фактором для роста фитотолерантного растения.
Результаты измерений представлены в виде таблицы 25.
Таблица 25 – Степень деградации нефти при загрязнении почвы 1%, 3%, 5%
№ опытного образца Степень деградации нефти при загрязненности почвы …, %
1% 3% 5%
3 19,13±1,60 5,17±0,41 0,89±0,02
4 34,01±3,12 13,41±1,50 7,79±0,26
5 46,23±3,20 14,98±1,20 10,37±1,09
6 58,39±4,30 18,51±1,70 12,21±1,22
7 75,89±5,70 26,19±2,31 19,47±1,51
На основании данных таблицы представлен рисунок 22 в виде диаграммы.
167640-339090Рисунок 22 – Степень деградации нефти при загрязнении почвы 1%, 3%, 5%
Представленная диаграмма, отображает степень деградации нефти в почве при различной ее концентрации (1, 3, 5%) в процессе использования обработанных группами микроорганизмов и не обработанных семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Ссылаясь на представленные в диаграмме данные, отчетливо видно, что в опытном образце №7, который предусматривал обработку семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) консорциумом микроорганизмов Rhizobium lotus и Pseudomonas delhiensis B-11400, наблюдается наибольший процент деградации нефти и составляет 75,89%. Это свидетельствует о том, что биопрепарат на основе растительно-микробной ассоциации является эффективным в отношении ремедиации нефтезагрязненных почв.
5 Обсуждение результатов исследований
На основании данных, полученных в результате проведения экспериментальной части выпускной квалификационной работы магистра, можно сделать следующие выводы:
Была изучена и отработана основная схема приготовления биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, включающая приготовление посевного материала, проведение глубинного периодического культивирования и концентрирования исследуемых микроорганизмов. Так же отработана схема инокуляции клеток микроорганизмов на носитель естественного происхождения – семена растения из семейства бобовые Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Были установлены совпадающие моменты при проведении глубинного периодического культивирования исследуемых микроорганизмов: рН 6,8-7,2 ед., 28˚ С
Было проведено глубинное периодическое культивирование исследуемых микроорганизмов. В результате были получены культуральные среды в объеме 2,5 дм3 для каждого микроорганизма. Конечное количество микробных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составило 12,4 млрд.ж.м.к/мл, Rhizobium lotus RL-5 – 15,2 млрд.ж.м.к/мл по биологической концентрации соответственно.
Был освоен процесс приготовления концентрированной суспензии исследуемых микроорганизмов. Объем полученных концентратов составил 1дм3 для каждого микроорганизма. Количество микробных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составило 49,7 млрд.ж.м.к/мл, Rhizobium lotus RL-5 – 48,81 млрд.ж.м.к/мл по биологической концентрации соответственно.
Был отработан основной метод инокуляции клеток исследуемых микроорганизмов на носителе – семенах растения семейства бобовые Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Количество жизнеспособных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составило 9,3 млрд.ж.м.к/г, Rhizobium lotus RL-5 – 5,9 млрд.ж.м.к/г по биологической концентрации соответственно.
Была установлена оптимальная доза внесения биопрепарата на единицу нефтезагиязненной площади в условиях эксперимента: 0,1 г (35 семян) на 128 см2.
Были установлены показатели фитотоксичности почвы. Было экспериментально доказано, что при увеличении концентрации нефти в почве от 1 до 5% наблюдается снижение показателей всхожести семян и формирования вегетативных частей растений
Были выявлены факторы, оказывающие действие на степень разложения углеводородов в почве с помощью растительно-микробной ассоциации, состоящей из иммобилизованных на носителе клеток микроорганизмов нефтедеструкторов и клетки ризобий-симбионтов нефтетолерантных растений семейства бобовые: влажность почвы, продолжительность нахождения и концентрация токсиканта в составе почвы.
Было определено, что растительно-микробная ассоциация, способна интенсифицировать деградацию нефти в почве при ее концентрации 1, 3 и 5%. Наивысшая степень деструкции нефти в почве была при ее концентрации 1% и через 10 сутки составила порядка 76%, что на 26% выше по сравнению с необработанными семенами растений.
6 Практическое предложение
Оформить результаты исследований по созданию биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, включающей иммобилизованные на семенах нефтетолерантного растения семейства бобовые Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) клеток микроорганизмов нефтедеструкторов Pseudomonas delhiensis B-11400 и клетки ризобий-симбионтов Rhizobium lotus RL-5 в виде нормативного документа, регламентирующего его производство и контроль.
ВЫВОДЫ
В настоящее время ухудшение экологической обстановки привело к возникновению ряда фундаментальных проблем. Прежде всего, это связано с выбросом в окружающую среду в значительных масштабах множества химических веществ, не в последнюю очередь это относится к нефти и нефтепродуктам. Попадая в среду, они загрязняют поверхностные и подземные воды, накапливаются в почве, наносят огромный ущерб животному и растительному миру.
На основании данных, полученных в результате проведения экспериментальной части выпускной квалификационной работы магистра, можно сделать следующие выводы:
1. Отработана схема приготовления биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, схема инокуляции клеток микроорганизмов на носитель естественного происхождения – семена Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Установлены совпадающие моменты при проведении глубинного периодического культивирования исследуемых микроорганизмов: рН 6,8-7,2 ед., 28˚ С
2. Проведено глубинное периодическое культивирование исследуемых микроорганизмов; получены культуральные среды в объеме 2,5 дм3 для каждого микроорганизма. Конечная концентрация микробных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составила 12,4 млрд ж.м.к/мл, Rhizobium lotus RL-5 – 15,2 млрд ж.м.к/мл.
3. Освоен процесс приготовления концентрированной суспензии исследуемых микроорганизмов; объем полученных концентратов составил 1дм3 для каждого микроорганизма, содержание микробных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составило 49,7 млрд ж.м.к/мл, Rhizobium lotus RL-5 – 48,81 млрд ж.м.к/мл
4. Отработан основной метод инокуляции клеток исследуемых микроорганизмов на носителе – семенах Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Концентрация жизнеспособных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составила 9,3 млрд ж.м.к/г, Rhizobium lotus RL-5 – 5,9 млрд ж.м.к/г.
5. Установлена оптимальная доза внесения биопрепарата на единицу нефтезагрязненной площади в условиях эксперимента: 0,1 г (15-35 семян) на 128 см2.
6. Выявлены факторы, оказывающие влияние на степень разложения углеводородов в почве с помощью растительно-микробной ассоциации: влажность почвы, продолжительность нахождения и концентрация токсиканта в составе почвы.
7. Определено, что растительно-микробная ассоциация способна интенсифицировать деградацию нефти в почве при ее концентрации 1%, 3% и 5%. Наивысшая степень деструкции нефти в почве была при ее концентрации 1% и через 10 сутки составила 76 %, что на 26 % выше по сравнению с необработанными семенами растений
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
т – тонна;
тыс. – тысяча;
м – метр;
млн. – миллион;
др. – другой;
т.д. – так далее;
т.к. – так как;
УВОМ – углеводородокисляющие микроорганизмы;
см – сантиметр;
мкм – микрометр;
т.е. – то есть;
у.е. – условные единицы;
г – грамм;
мг – миллиграмм;
мм – миллиметр;
мин. – минута;
мкл – микролитр;
НИР – научно-исследовательская работа;
tср – средняя температура;
ч – час;
Оп.ед. – оптические единицы;
ПДК – предельно-допустимая концентрация;
% - процент;
°С – градус Цельсия;
рН – водородный показатель;
млрд.ж.мк.к/мл – миллиард живых микробных клеток в миллилитре;
Ч.Д.А. – чистый для анализа;
Х.Ч. – химически чистый;
Ч. – чистый;
ПС –питательная среда;
ППС – плотная питательная среда;
ЖПС – жидкая питательная среда;
МПА – мясопептонный агар;
МПБ – мясопептонный бульон;
КГКДА – кислотный гидролизат казеина и дрожжевой автолизат;
МДА — маннитно-дрожжевой агар;
ВКПМ – Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов.
СПИСОК ОПРЕДЕЛЕНИЙ И ТЕРМИНОВ
Биодеструкция (биоразрушение) – это преобразование сложных веществ с помощью биологической активности, включает: 1) трансформацию, или незначительные изменения молекулы; 2) фрагментацию, или разложение сложной молекулы на более простые соединения и 3) минерализацию, или превращение сложного вещества в самые простые (Н2О, СО2, Н2, NH3, СН4 и т.д.).
Биоремедиация — комплекс методов очистки вод, грунтов и атмосферы с использованием метаболического потенциала биологических объектов — растений, грибов, насекомых, червей и других организмов.
Фиторемедиаци — комплекс методов очистки сточных вод, грунтов и атмосферного воздуха с использованием зеленых растений.
Глубинное культивирование – это способ выращивания микроорганизмов в жидкой питательной среде ниже ее поверхности.
Концентрирование – это способ разделения компонентного состава исследуемой смеси, в результате которого увеличивается отношение концентрации микрокомпонента к макрокомпоненту.
Культуральная (питательная) среда – субстрат, состоящий из компонентов, обеспечивающих необходимые условия для культивирования микроорганизмов или накопления продуктов их жизнедеятельности.
Культуральная жидкость — жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток.
Список используемых источников
Экологические проблемы загрязнения нефтью почв сельскохозяйственного [Текст] / Ульянова О.В., Нечкина М.А., Мохонько Ю.М., Данилова С.А., Калмыков С.И. // Фундаментальные исследования. – 2007. – № 12. – С. 192-193.
Режимы раздельного и совместного культивирования микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rodococcus [Текст] / Филонов А.Е. и др. // Биотехнология.-2008. - №6. - С. 80-85
Головцов, М.В. Переработка нефтешламов с последующей доочисткой до экологически безопасного уровня: автореферат дис. канд. биол. Наук [Текст] / М.В. Головцов.- Уфа, 2008.- 26.
Биотехнология защиты окружающей среды: Учебное пособие[Текст] / Решетилов А.Н., Решетилова Т.А., Шкидченко А.Н., Кошелева И.А., Иванова Е.С., Блохин И.В. - ТулГУ Тула, 2006. - 114 с.
Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биремедиации почв и водной среды [Текст] / Андреева И.С., Емельянова Е.К., Загребельный С.Н., Олькин С.Е., Резникова И.К., Репин В.Е. // Биотехнология. - 2006. - № 1. - С. 43-52.
Давыдова, С.Л. Нефть и нефтепродукты в окружающей среде: Учеб. Пособие [Текст] / С.Л. Давыдова, В.И. Тагасов - М., 2004. – 163 с.
Петров, А.А. Углеводороды нефти [Текст] / А.А. Петров. - М: Химия, 1984. – 128 с.
Проскурякова, В.А. Химия нефти и газа [Текст] / В.А. Проскурякова, А.Е. Драпкина - Л., Химия - 1989. – 364 с.
Лебедев, Н.Н. Химия и технология основного органического и нефтехимического синтеза [Текст] / Н.Н.Лебедев. - М: Химия, 1988. – 345 с.
Эрих, В.Н. Химия и технология нефти и газа[Текст] / В.Н.Эрих, М.Г. Расина, М.Г. Рудин. - Л., Наука - 1985. – 547 с.
Поконова, Ю.В. Нефть и нефтепродукты [Текст] / Ю.В. Поконова – СПб: Промис, 2003. – 644 с.
Серебряков, Б.Р. Новые процессы органического синтеза [Текст] / Б.Р. Серебряков, Р.М. Масагутов, В.Г. Правдин. - М., Химия - 1989. – 400 с.
Рябов, В.Д. Химия нефти и газа [Текст] / В.Д. Рябов. - М: Техника, 2004. – 288 с.
Пэрэушану, В. Производство и использование углеводородов [Текст] / В. Пэрэушану, М.Коробя, Г. Муска. - M., Мир - 1987. – 247 с.
Крылов, О.В. Гетерогенный катализ [Текст] / О.В. Крылов. – М: Академкнига, 2004. – 679 с.
Каминский, Э.Ф. Глубокая переработка нефти: технологический и экологический аспекты [Текст] / Э.Ф. Каминский, В.А. Хавкин. - М., Техника - 2004. – 383 с.
Глинка, Н. Л. Общая химия [Текст] / Н.Л. Глинка. -  М: Интеграл-Пресс, 2008. – 728 с.
Жукова, О.В. К вопросу о биодеградации и биодеструкции (биоремедиации) нефтяных загрязнений в окружающей среде, как фактор чистой экологии [Текст] / О.В. Жукова// Актуальные вопросы естествознания начала 21 века: - Казань: Печать-Сервис-XXI век, 2011.- С.110-112.
Морозов, Н.В. Экологическая защита окружающей среды от нефтяных загрязнений, технологическая схема биоочистки нефтесодержащих стоков [Текст] / Н.В. Морозов, О.В. Жукова // Фундаментальные и прикладные исследования в системе образования. – Тамбов: изд-во Першина Р.В, 2008.-Т.3.-С.58 -60.
Влияние нефтепромыслов на растительный и животный мир Камского Предуралья [Текст] / С.А. Бузмаков, И.В. Ладыгин // Тез. докл. межгос. научн. конф. – Пермь, 1993. - С. 201-205.
Драчева, Ю.Ю. Физиологическая активность микроорганизмов, выделенных из дерновоподзолистой почвы с нефтяным загрязнением, в разных экологических условиях [Текст] / Ю.Ю. Драчева, Е.А. Матенькова // Химия и жизнь: сб. тез. и докл. регион. науч.-практ. конф. Новосиб. гос. аграр. ун-т. – Новосибирск, 2011. - С.193-195.
Матенькова, Е.А. Влияние нефтяного загрязнения на биологическую активность почвы [Текст] / Е.А. Матенькова// Тр. Всерос. совета молодых ученых и специалистов аграр. образоват. и науч. учр. / Рос. акад. наук. - М., 2009. - Том 2. - С.6770.
Хуснетдинова, Л.З. Создание бактериальных препаратов-деструкторов углеводородов и их использование в восстановлении качества поверхностных вод [Текст] / Л.З. Хуснетдинова, О.В. Жукова, Н.В. Морозов // Материалы Всеросс. науч.-практ. конф. «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию».- Казань: ТГГПУ, 2009.- С. 295-297
Коронелли, Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде [Текст] / Т.В. Коронелли // Прикл. биохим. и микробиол. - 1996. - Т. 32. № 6. - С. 579-585.
Ягафарова, Г.Г. Комплексная технология очистки нефтешламов [Текст] / Г.Г. Ягафарова, С.В. Леонтьева, А.Х. Сафаров, И.Р. Ягафаров, М.В. Головцов // Нефтепереработка-2008: материалы международной научно-практической конференции. – Уфа, 2008. – С. 330-331.
Барахнина, В.Б. Альготестирование нефтезагрязненных почвогрунтов [Текст] / В.Б. Барахнина, Г.Г. Ягафарова, Л.С. Колесникова, М.В. Головцов. – Самара, 2007.-№ 7(102). – С. 35-40
Гайнутдинов, М.З. Рекультивация нефтезагрязненных земель лесостепной зоны Татарии [Текст] / М.З. Гайнутдинов, С.М. Самосова, Т.И. Артемьева, М.Ю. Гилязов, И.Т. Храмов, И.А. Гайсин, В.И. Фильченкова, А.К. Жеребцова . - М., Наука, 1988. -177-197 с.
Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями [Текст] / И.С. Звягинцева, Э.Г. Суровцева, М.Н. Поглазова, B.C. Ивойлов, С.С. Беляев // Прикл. биохим. и микробиол. – 2001. - Т. 70. № 3. - С. 321-328.
Руководство по химическому анализу поверхностных вод суши / Под ред. А. Д. Семенова. — Л.: Гидрометеоиздат, 1977. — 542 с.
Другов, Ю.С. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. Практическое руководство [Текст] / Ю.С. Другов, А.А. Родин. - М., БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. - 270 с.
Калюжный, C.B. Биотехнология защиты окружающей среды: единство биокаталитических и инженерных подходов [Текст] / С.В. Калюжный // Известия академии наук. Серия химическая. - 2001. - №10. - С. 1735-1742.
Методические указания по санитарной охране водоемов от загрязнения нефтью. — М.: Изд. Минздрава СССР, 1976.—44 с.
Векилов, Э.Х. Проблемы охраны окружающей среды при разработке морских месторождений нефти и газа [Текст] / Э.Х. Векилов // ЭИ ВНИИОЭНГ. Сер. Освоение ресурсов нефти и газа морских месторождениий. - 1980. - № 1. - С. 17-19.
Марков, Н.В. Циклон — морской санитар [Текст] / Н.В. Макров, Г.Ю. Степанов // Нефтяник. - 1977. - № 2. - С. 7-8.
Рубан, В.К. Промышленные испытания устройства для сбора нефти с поверхности воды при аварийных разливах [Текст] / В.К. Рубан, Л.А. Полевин, Т.И. Стоянов и др. //Транспорт и хранение нефти и нефтепродуктов. - 1976. - № 3. - С. 22-24.
Линский, В.К. Безнапорные гидроциклоны для сбора нефтяных загрязнений с поверхности воды [Текст] / В.К. Линский, Е.Г. Тихонов //Охрана окружающей среды: Респ. межвед. сб. — Минск, 1982. - №3. - С. 10—12.
Линский, В.К. Применение безнапорных гидроциклонов на водоохранных объектах нефтеперерабатывающего завода [Текст] / В.К. Линский, Е.Г. Тихонов, П.В. Коваленко // Охрана окружающей среды: Респ. межвед. сб. — Минск, 1985. - №. 4. - С. 43 - 44.
Фролова, М.К. Полиэтиленовые композиционные материалы для противофильтрационных устройств гидротехнических сооружений [Текст] / М.К. Фролов//Материалы конференций и совещаний по гидротехнике. - Л.: Энергоатомиздат, 1986. - С. 19-20.
Седлухо Ю.П. Строительство очистных сооружений на нефте- промыслах [Текст] / Ю.П. Седлухо // Обзор. информ. ВНИИОЭНГ. Сер. Нефтепромысловое строительство. - М., 1982. — 38 с.
Немировский, И.А. Исследование полиуретанового пенопласта как средства удаления нефти с поверхности моря [Текст] / И.А. Немировский, Н.М. Ануфриева, А.Б. Горницкий. - АН СССР. - 1975. - 29-32 с.
Использование пластмассовых микробаллонов (пламилона) для сбора нефти с поверхности водоемов [Текст] / Н.Ф. Кагарманов, А.У. Шарипов, К.Л. Минхайров и др. // Нефтяное хозяйство. - 1978. - № 9. - С. 21-23.
Хабибуллина, Ф.М. Биосорбент для очистки водоемов от нефтепродуктов на основе штаммов бактерий и дрожжевых грибов [Текст] / Ф.М. Хабибуллина [и др.] // Патент № 2318736. Зарегистр. 10.05.2008 г.
Жуков, А.И. Методы очистки производственных сточных вод [Текст]/А.И. Жуков, М.Л. Монгайт, И.Д. Родзиллер. - М., Стройиздат, 1987. - 214 с.
 Лукиных, Н.А. Методы доочистки сточных вод [Текст] / Н.А. Лукиных. - М.: Стройиздат, 1988. - 156 с. 
Горницкая, А.Б. Исследование возможности применения сорбирующих материалов для ликвидации разливов нефти на море [Текст] / А.Б. Гарницкая, Н.М. Ануфриева, М.П. Нестерова // Океанология. - 1977. - Т. 17. - №6. - С. 49-51.
 Нестерова, М.П. Средства и методы предотвращения загрязнения моря [Текст] / М.П. Нестерова // Тез. докл. Тихоокеан. научн. конгр. Хабаровск, - М., 1979. - С. 3-4.
Редкозубов, С.В. Перспективы утилизации нефтешлама методом биоремедиации в рамках Жирновского ЦДНГ [Текст] / С.В. Редкозубов // Актуальные проблемы естественных наук: Матер. междунар. заочной науч.-практ. конф. – Тамбов, 2010. – C. 141-147.
Ас. 1270209 СССР, МКИ Е02В 15/04, С 09КА 3/32. Состав для очистки поверхности воды от нефтяных загрязнений.
Заявка 3732013 ФРГ, МКИ Е02 В 15/04, C02F 1/28. Способ связывания нефти в нефтеводяной суспензии.
Андерсон, Д.М. Экология и науки об окружающей среде: биосфера, экосистемы, человек [Текст] / Д.М. Андерсон. - Л.: Гидрометеоиздат, 1985. - 164 с.
Гриднева, В.В. Выделение и исследование микроорганизмов, обладающих углеводородокисляющими свойствами [Текст] / В.В. Гриднева // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышл. «АСТИНТЕХ- 2010»: материал. Международ. Научн. Конф. 11-14 мая 2010 г.-Т. 3. - С. 20-21
Гриднева, В.В. Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов /В.В. Гриднева // Международная отраслевая научная конференция профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященная 80-летию основания АГТУ (54 ППС): тез. докл. в 2 т [Текст] / под общ. ред. Н.Т. Берберовой, А.В. Котельникова – Астрахань: Изд-во АГТУ, 2010. - Т.1. – С. 296.
 Сидорова, Е.Г. Опыт применения биопрепарата "Деворойл"" для очистки почв газотранспортных объектов от углеводородного загрязнения. Проблемы управления качеством продукции, сертификации и экологии в условиях рыночных отношений и пути их решения [Текст] /Е.Г. Сидорова, Д.Г. Сидоров, Г.С. Акопова. - М., 1994. – 115 с.
Дорот, М.И. Исследование загрязнения почв и грунтовых вод при строительстве скважин и разработка мер по защите [Текст] / М.И. Дорот, Н.Н. Фасенко, А.Я. Демщенко // Тез. докл. Всесоюз. совещ. Проблемы охраны окружающей среды в нефтяной и газовой промышленности. - М., 1985. - С.-19.
 Фильченкова, В.И. Биологическая активность обыкновенного чернозема при нефтяном загрязнении [Текст] / В.И. Фильченкова // 3ащита растений и охрана окружающей среды в ТатАССР. - Казань, 1982. - С. 74-75.
Солнцева, Н.П. Особенности загрязнения почв при нефтедобыче [Текст] / Н.П. Солнцева // Тр. Всесоюз. совещ. - Д. Гидрометеоиздат, 1985. - С. 62 - 65.
Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон [Текст] / Т.В. Коронелли, С.Г. Дермичева, В.В. Ильинский и др. // Микробиология. – 1974. - Т.63, № 5. - С.579-585.
Ткаченко, В.Н. Влияние нефтяных углеводородов на микробентос литорали Белого моря [Текст] / В.Н. Ткаченко, И.В. Бурковский // Экология. – 1986. - № 5. - С.9-15.
Шлегель, Г. Современная микробиология [Текст] / Г. Шлегель, И. Ленгелер пер. с англ., - М., Мир, 2005. - 281 с.
Ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов для ремедиации нефтезагрязненных территорий [Текст] / А.В. Мокеева, А.Ю. Алексеев, Е.К. Емельянова, В.А. Забелин, А.В. Заушинцена, А.С. Тараканова, А.М. Шестопалов, Т.Н. Ильичева // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2011. - Т. 9, № 3. - С. 27-34.
Joo H.-S., Ndegwa P. M., Shoda M., Phae Ch.-G., Bioremediation of oil-contaminated soil using Candida catenulata and food waste. // Environmental Pollution. - 2008. - V. 156. - No. 3. - P. 891-896.
Ghazali F.M., Rahman R.N., Salleh A.B., Basri M., International Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial consortium. // Biodeterioration & Biodegradation. - 2004 - V. 54. - No. 1. - P. 61-67
Rahman K. S. M., Thahira-Rahman J., Lakshmanaperumalsamy P., Banat I. M., Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium. // Bioresource Technology. - 2002. - V. 85. - No. 3. - P. 257-261.
Подбор ассоциации микроорганизмов-деструкторов нефтяной фракции твердых алканов при низких положительных температурах [Текст] / А.Ю. Алексеев, Е.А. Смородина, Л.С. Адаменко, Е.К. Емельянова, В.А. Забелин, Т.Н. Ильичева, В.А. Резников, А.М.Шестопалов // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - № 6. – С. 34-41.
Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ. [Текст] / Под ред. Дж. Хоула, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. — М., Мир, 1997. - 368 с.
McLeod, M. Full genome Rhodococcus sp. / M. McLeod. - National Academy of Sciences, 2006. - Tom 103. - p. 15582-15587.
Lihitinger, T. Biochemical identification and biophysical characterization of Rhodococcus erythropolis / T. Lihitinger / / Bacteriology. -2009. - № 182. - p. 764-770.
Patrauchan, MA and. others. ". catabolism benzoate and phthalate in Rhodococcus sp Strain RHA1: redundancies and convergence." Journal of Bacteriology. 2005. Volume 187. p.4050-4063.
Megharaj, M. et al. 2003. Toxicity of Hexavalent Chromium and Its Reduction by Bacteria Isolated from Soil Contaminates with Tannery Waste. Current Microbiology, 47: 51-54.
F.A.O Camargo, F.M. Bento, B.C. Okeke, and W.T. Frankenberger (2003). "Hexavalent chromium reduction by an actinomycete, Arthrobacter crystallopoietes ES 32". Biological Trace Element Research97 (2): 183–194.
Pinar, Guadalupe & Juan L. Ramos. 1998. A strain of Arthrobacter the tolerates high concentrations of nitrate. Biodegradation, 8: 393-399.
Wauters, Georges et al. 2000. Identification of Arthrobacter oxydans, Arthrobacter luteolus sp. nov., and Arthrobacter albus sp. nov., Isolated from Human Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology, 38: 2412-2415.
K Westerberg, AM Elvang, E Stackebrandt and JK Jansson (2000). "Arthrobacter chlorophenolicus sp. nov., a new species capable of degrading high concentrations of 4-chlorophenol". International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50: 2083–2092. PMID 11155983.
Madigan M; Martinko J (editors). (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th ed.). Prentice Hall.
Krieg, Noel (1984). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 1. Baltimore: Williams & Wilkins.
O'Mahony MM, Dobson AD, Barnes JD, Singleton I (2006). "The use of ozone in the remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soil". Chemosphere 63 (2): 307–314.
Yen KM, Karl MR, Blatt LM et al. (2010). "Cloning and characterization of a Pseudomonas mendocina KR1 gene cluster encoding toluene-4-monooxygenase". J. Bacteriol. 173 (17): 5315–27.
Huertas MJ, Luque-Almagro VM, Martínez-Luque M et al. (2006). "Cyanide metabolism of Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344: role of siderophores". Biochem. Soc. Trans. 34 (Pt 1): 152–5
Nojiri H, Maeda K, Sekiguchi H et al. (2008). "Organization and transcriptional characterization of catechol degradation genes involved in carbazole degradation by Pseudomonas resinovorans strain CA10". Biosci. Biotechnol. Biochem. 66 (4): 897–901
Nam et al. (2009). "A novel catabolic activity of Pseudomonas veronii in biotransformation of pentachlorophenol". Applied Microbiology and Biotechnology 62 (2–3): 284–290
Onaca et al. (May 2007) [Mar 9, 2007 (Epub ahead of print)]. "Degradation of alkyl methyl ketones by Pseudomonas veronii". Journal of Bacteriology 189 (10): 3759–3767
Marqués S, Ramos JL (2001). "Transcriptional control of the Pseudomonas putida TOL plasmid catabolic pathways". Mol. Microbiol. 9 (5): 923–929
Sepulveda-Torres et al. (2000). "Generation and initial characterization of Pseudomonas stutzeri KC mutants with impaired ability to degrade carbon tetrachloride". Arch Microbiol 171 (6): 424–429
Разработка экспериментального биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов, предназначенного для биоремедиации загрязненных нефтепродуктами почв Нечерноземной зоны России [Текст] / Т.С. Кардакова, А.Г. Лазыкин, К.Е. Гаврилов, И.В. Дармов // отчет по научно-исследовательской работе. - ВГУ, 2012. – 5 c.
ТУ 64-16-75-91. Препарат бактериальный Путидойл
Новиков, Ю.В. Исследования бактериального препарата Путидойл, предназначенного для очистки водоемов от нефти [Текст] / Ю.В. Новиков, Н.В. Комзолова // Водное хозяйство. – 1992. - №2. - с. 121-123.
Патент РФ 2193533. Биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / В.А. Чугунов, В.П. Холоденко, З.М. Ермоленко, В.М. Кондрашенко, И.А. Дунайцев, С.К. Жиглецова, И.И. Мартовецкая, Р.И. Миронова, Н.А. Жиркова. Заявл. 27.09.1999. Опубл. 27.11.2002
Патент РФ 2465217. Биопрепарат для очистки водных сред от нефти и нефтепродуктов / М.Ю. Маркарова, И.Э. Шарапова, А.В. Гарабаджиу. Опубл. 23.05.2008.
Патент РФ 2053206. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов / М.Д. Белонин, Е.А. Рогозина, Р.М. Свечина, А.В. Хотянович, Н.А. Орлова. Опубл. 27.01.2009.
Патент РФ 2174496. Биопрепарат "родер" для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов / В.П. Мурыгина, Н.Е. Войшвилло, С.В. Колюжный. Заявл. 31.05.1999. Опубл. 10.10.2001
Патент РФ 2023686. Консорциум микроорганизмов Rhodococcus sp., Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, candida sp., используемый для очистки почвенных и солоноватоводных экосистем от загрязнения нефтепродуктами / И.А. Борзенков, Е.И. Милехина, С.С. Беляев, М.В. Иванов. Заявл. 17.02.2003; Опубл. 10.07.2008.
http://www.devoroil.ru
Литвинов, Е.А. Методические рекомендации по применению биологических средств защиты растений и микробиологических удобрений в растениеводстве и методика выполнения целевого индикатора государственной программы «Рост применения биологических средств защиты растений и микробиологических удобрений в растениеводстве с 27,1 до 32,2%» [Текст] / Е.А. Литвинов. - Волгоград, 2013. – 64 с.
ttp://suprinol.clean-ural.ru
http://www.nefteshlamy.ru
Бакулин, М. К. Приготовление питательных сред и подготовка посуды для культивирования микроорганизмов. Виды питательных сред. Техника посева микроорганизмов в жидкие, полужидкие и на плотные питательные среды [Текст] / М.К. Бакулин. - Киров, 1997.
Турковская, О.В., Муратова А.Ю. Биодеградация органических поллютантов в корневой зоне растений [Текст] // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциированных микроорганизмов с растениями. М.: Наука, 2005. С. 180- 208.
Хазиев, Ф.Х., Тишкина Е.И., Киреева Н.А., Кузяхметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агроэкосистемы [Текст] // Агрохимия. 1988. № 2. С. 56- 61.
Беспамятнов, Г.П. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде [Текст] / Г.П. Беспамятнов, Ю.А. Кротов. Л., 1985.-528 с.
Глазовская, М.А. Скорость самоочищения почв от нефти в различных природных зонах [Текст] / М.А. Глазовская, Ю.И. Пиковский // Природа. -1980. - №5. - С.118-119.
Глазовская, М.А. Способность среды к самоочищению [Текст] / М.А. Глазовская // Природа. 1979. - №5. - С.71-79.
Гумеров, Р.С. Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды [Текст] / Р.С. Гумеров, Р.З. Абзалов, Р.А. Мамлеев // Обзор, информ. ВНИИОЭНГ. Сер. Борьба с коррозией и защита окружающей среды. М., 1987. - Вып.6. - 53 с.
Jones R., Sun W., Tang C.S., Robert F.M. Phytoremediation of petroleum hydrocarbons in tropical coastal soils. II. Microbial response to plant roots and contaminant // Environ Sci. Pollut. Res. 2004. V. 11. Р. 340-346.
Davies J.S. Westlake D.W.S. Crude oil utilization by fungy. Canad. J. Microbiol. 1970. v. 25, N 2 р. 146-156
Веселовский, В.А. Биотестирование загрязнения среды нефтью по реакции фото синтетического аппарата растений [Текст] / В.А. Веселовский, B.C. Вшивцев // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: сб. ст. М.: Наука, 1988. - С. 99-112.
Водопьянов, В.В. Фитотоксичность нефтезагрязненных почв [Текст] / В.В. Водопьянов, Н.А. Киреева, Е.М. Тарасенко // Агрохимия. 2004. - №10. - С 73-77.
Андресон, Р.К. Борьба с загрязнением почвогрунтов. Нефть [Текст] / Р.К., Андресон, Ф.Х. Хазиев //Обзор, информ. М.: ВНИИОЭНГ, 1981. -45 с.
Бакач, Т. Охрана окружающей среды [Текст] / Т. Бакач. М.: Медицина, 1980. -216 с.
Белоусов, B.C. Биотехнологические приемы предотвращения деградационных процессов в почвах южных регионов России [Текст] / С.В. Редкозубов // Актуальные проблемы естественных наук: Матер. междунар. заочной науч.-практ. конф. – Тамбов, 2010. – C. 141-147.
Белоусов, B.C. Обоснование и разработка биотехнологических приемов реабилитации экологически неблагоприятных ландшафтов [Текст] / B.C. Белоусов, А.А. Швец // Наука Кубани . 2007. - №4, приложение. - С. 53-56.
Белоусов, B.C. Оценка устойчивости сельскохозяйственных культур к загрязнению нефтью чернозема выщелоченного Западного Предкавказья [Текст] / B.C. Белоусов, А.А. Швец // Тр. / КубГАУ. -Краснодар, 2009.Вып. № 4 (19). - С. 133-135.
Белоусов, B.C. Фитомелиорация деградирующих почв с помощью сорговых культур [Текст] / B.C. Белоусов // Селекция, семеноводство, технология возделывания и переработки сорго: материалы Междунар. науч.-практ. конф. Зерноград, 1999. - С. 17.
Гусев, М.В. Микробиологическое разрушение нефтяного загрязнения [Текст] / М.В. Гусев, Т.В. Коронелли // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1981. - №6. - С.835-844.
Даваева, Ц.Д. Исследование трансформации свойств чернозема при воздействии нефти в модельном эксперименте [Текст] / Ц.Д. Даваева // Бюл. Ботан. сада Сарат. гос. ун-та. 2006. - № 5.- С. 195 -198.
Иларионов, С. А. Использование биогумуса и активного ила в рекультивации нефтезагрязненных земель [Текст] / С.А. Иларионов, И.Г. Калачникова // Освоение Севера и проблемы рекультивации: материалы 3 Междунар. конф. Санкт-Петербург, 1996. - С. 52-53.
Иларионов, С.А. Самоочищение нефтезагрязненных почв и их рекультивация [Текст] / С.А. Иларионов // Освоение Севера и проблемы рекультивации: материалы 3 Междунар. конф. Санкт-Петербург,1996.-С. 51-52.
Смиронов, В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода псевдомонас [Текст] / Киев: Наук. Думка, 1990. С. 84-111.
Cook R.J., Baker K.F. The Nature and Practice of Biological Control of Plants Pathogens // St. Paul (Minn.): Amer. Phytopathol. Soc., 1989. P. 1-539.
Мавроди, Д.В., Ксензенко В.Н., Чатуев Б.М. Структурно-функциональная организация генов псевдомонад, кодирующих ферменты биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты [Текст] // Молекулярная биология. 1997. Т. 31. - С. 76-88.
Комоско, Г.В. Мембранное концентрирование с использованием установки «Сартокон - мини». Методические указания по учебной практике [Текст] / Г.В. Комоско, А.А. Лещенко. – ВГУ, 2005. – 29 с.
Борисова, Г.А. Влияние регуляторов роста и бактериальных препаратов на морфофизиологические особенности и продуктивность проса. [Текст] / Автореф. Дис. канд. с.-х. наук, М.: - 1999.-23 с.
Троицкая, Г.Н. Особенности азотфиксирующих систем клубеньков различных видов бобовых растений [Текст] / Г.Н. Троицкая, Н.Н. Кудрявцева, В.Б. Ильясова и др. // Физиология растений. 1979. - т. 26.-вып. 2.-С. 1011-1022.
Тхагапсоев, М. X. и др. Влияние инокуляции штаммами ризобий на динамику количества и массы клубеньков растений зернобобовых культур [Текст] // Зерновое хозяйство. 2005. - № 8. - С. 20-21.
Черствый, JI.C. Губанова, Т.А. Граб // Микробиология. -1986. № 1. -С. 143-147.
Чундерова, А.И. О взаимоотношении клубеньковых бактерий с растением хозяином и перспективах повышения эффективности симбиоза [Текст] // Труды ВНИИСХ микробиологии.-1980. Т.50. -С. 7-29.
Чундерова, А.И. О генетике бобово-ризобиального симбиоза [Текст] // С.-х. биология. 1981. - Т. 16. - № 3. - С. 403-406.
Шемаханова, Н.М. Роль бобовых растений в эффективном симбиозе с клубеньковыми бактериями [Текст] // Микробиология. — 1976. Т. 45. - вып. 6. - С.34-38 .
Шильникова, В.К. Азотфиксирующие бактерии, жизнь растений [Текст] / Т. 1. М.: Просвещение. - 1974. – 202 с.
Сичкарь, В.И. Селекция сои на адаптивность к факторам внешней среды [Текст] // Автореферат. Одесса. - 1990. - 36 с.
Смарт, Дж. Генетическое улучшение зернобобовых культур [Текст] // Химия и биология бобовых растений. Перевод К.С. Спектрова под ред. М.Н. Запрометова. М.: Агропромиздат. - 1986. - С. 311-332.
Рассказов, С.М Фотосинтетическая деятельность, рост и формирование урожая у морфотипов зерновых бобовых культур [Текст] // Сб. науч. тр. Бобовые культуры в современном сельском хозяйстве. Новгород. - 1998. - С. 154-156.
Бакулин, М.К. Микробиология: лабораторный практикум. Учебное пособие: спец. 020209 [Текст] / М.К.Бакулин. – Киров, Изд-во ВятГУ, 2008. – 299 с.
Патент РФ 2289606 . Способ изготовления торфобрикетов / Ю. С. Жучихин, А. Н. Козьминых, В. Ю. Муратов, Г. М. Тулянкин; ЗАО «Маркетинг-Бюро»; Заявл. 04.07.2005; Опубл. 20.12.2006.
Анализатор содержания нефтепродуктов в воде лабораторный АН-2. Руководство по эксплуатации/ ООО «Нефтехимавтоматика». - СПб, 2011. – 43 с.
Количественный химический анализ вод. Методика измерений массовой концентрации нефтепродуктов в воде на анализаторе АН-2 АИП 2 840.056.1: Методические рекомендации. – СПб.: ООО «Нефтехимавтоматика СПб», 2011 – 15с.
Приложение 1
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования
Вятский государственный университет
Институт биологии и биотехнологии
Направление 06.03.01 Биология
Направленность Микробиология
УТВЕРЖДАЮ
Заведующий кафедрой микробиологии
д.м.н., профессор
_______________________И.В. Дармов
« » апреля 2016 г.
Задание на выполнение выпускной квалификационной работы
Студент Коновалова Екатерина Анатольевна, группа мБМ-21
Тема: «Разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, предназначенной для ремедиации нефтезагрязненных почв»
(Утверждена приказом по университету №13-02-2-2 от 28.04.2016 г.)
1. Исходные данные к работе: Труды отечественных и зарубежных авторов по изучению бактерий – продуцентов хитиназ, способам их выделения, идентификации и изучения хитинолитической активности.
2. Планируемое содержание работы:
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….…………... ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ……………………………………………..…………... 1 Обзор литературы…………………………………….……...……………. 1.1 Нефть и нефтепродукты, как источник загрязнения почвы…...…..…... 1.1.1 Основные физические и химические свойства нефти и нефтепродуктов………………………………………………………………………….. 1.1.2 Нефтяные загрязнение почв и их последствия……………..……….... 1.2 Основные методы ликвидации нефтяных загрязнений в почве………. 1.2.1Биоремедиация……………………………………….………………….. 1.2.2 Фиторемедиация……...…………………………………………….…... 1.2.2.1 Растения, применяемые в фиторемедиации нефтезагрязненных почв…………………………………………………………………………….. 1.2.2.2 Технологии проведения фиторемедиационных мероприятий…….. 1.2.3 Сочетание процессов био- и фиторемедиации. Составление растительно-микробной ассоциации……………………….. 1.2.3.1 Получение микробного компонента ………………… 1.2.3.2 Подготовка растительного компонента. Метод инокуляция семян растений-фиторемедиантов………………… 1.2.4 Практическое применение растительно-микробных ассоциаций…… 1.3 Выводы по обзору научно-технологической и патентной информации 2 Выбор направлений исследований……………………………………..….. 3 Материалы и методы…………………………………………………...…... 3.1 Микроорганизмы. Семена исследуемого растения…………………… 3.2 Питательные среды, реактивы, расходные материалы………………… 3.3Приборы и оборудование……………………………………………….… 3.4 Методы исследований………………………………………...………….. 3.5 Методы статистической обработки экспериментальных данных…...… 4 Экспериментальные исследования…………………………………..……. 4.1 Оценка морфологических и культуральных свойств микроорганизмов р. Pseudomonas и р. Rhizobium………………………………………...……... 4.2 Интенсификация фиторемедиационных процессов в почве загрязненной нефтью, с применением симбиотических бактерий рода Rhizobium в качестве стимулятора роста растения, а также микроорганизма – нефтедеструктора……………………………………………………………………. 4.2.1 Получение концентрированной суспензии микроорганизмов……..... 4.2.1.1 Оптимизация условий глубинного периодического культивирования исследуемых микроорганизмов р. Pseudomonas и р. Rhizobium…………………………………….…………….. 4.2.1.2 Отработка условий концентрирования исследуемых микроорганизмов р. Pseudomonas и р. Rhizobium……………………………………………….…….. 4.3 Разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, предназначенной для ремедиации нефтезагрязненных почв………………………………………………………….……. 4.3.1 Предпосевная обработка культурами микроорганизмов семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus)……………………………………………………….………... 4.3.2 Общее влияние нефтяного загрязнения на рост и развитие микроорганизмов и используемых растений…………………...…. 4.4 Оценка нефтеокисляющей активности растительно-микробной ассоциации в процессе применения на нефтезагрязненной почве………………………...……. 5 Обсуждение результатов исследований……………………………………….. 6 Практическое предложение……………………………………..…………. ВЫВОДЫ…………………………………………………………………..….. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ……………. СПИСОК ОПРЕДЕЛЕНИЙ И ТЕРМИНОВ………………………………… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………. ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Задание на выполнение выпускной квалификационной работы…………………………………………….. ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Авторская справка……………………………………. ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Доклад по дипломной работе………………………... ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Презентация…………………………………………… ПРИЛОЖЕНИЕ 5 Отзыв руководителя………………………………….. 3. Перечень графического материала:22 слайдов
4. Календарный план работы
1. Теоретические и экспериментальные исследования – апрель – май
2. Оформление текста, таблиц, иллюстраций, доклада – май – июнь
3. Подготовка к защите – июнь
4. Предъявление выполненной работы заведующему кафедрой на подпись – 30 июня 2016 г.
5. Дата выдачи задания – « » апреля 2016 г.
Руководитель___________________ Лазыкин А. Г
Исполнитель ____________________ Коновалова Е.А
Приложение 2
АВТОРСКАЯ СПРАВКА
Я, Коновалова Е.А., автор дипломной работы «Разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, предназначенной для ремедиации нефтезагрязненных почв», сообщаю, что мне известно о персональной ответственности автора за разглашение сведений, подлежащих защите законами Российской Федерации о защите объектов интеллектуальной собственности.
Одновременно сообщаю следующее:
1. При подготовке к защите дипломной работы и опубликовании её материалов не использованы источники (документы, отчеты, диссертации и др.), имеющие гриф секретности или «Для служебного пользования».
2. Данная работа не содержит сведений, официально не разрешенных к опубликованию.
3. Данная работа не содержит научную, техническую, коммерческую или иную информацию, разглашение которой способно нанести ущерб интеллектуальной собственности ФГБОУ ВО «BятГУ» или других юридических или физических лиц.
4. В тексте дипломной работы нет сведений, на опубликование которых необходимо получать разрешение юридических или физических лиц.
5. Согласна на использование моей работы безвозмездно в учебном процессе и научных исследованиях, проводимых в ФГБОУ ВО «BятГУ».
___________________ Е.А. Коновалова
« » июля 2016 г.
Сведения по авторской справке подтверждаю:
Заведующий кафедрой микробиологии
д.м.н., профессор __________________ И.В. Дармов
« » июля 2016 г.
Приложение 3
Доклад
Слайд 1
Глубокоуважаемые председатель, члены комиссии и все присутствующие. Вашему вниманию предлагается доклад по выпускной квалификационной работе на тему «Разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, предназначенной для ремедиации нефтезагрязненных почв».
Слайд 2
Выпускная квалификационная работа выполнена на кафедре микробиологии ВятГУ.
Слайд 3
Нефть и нефтепродукты являются не только самыми распространенными источниками топлива и энергии в мире, но и наиболее крупномасштабными загрязнителями окружающей среды.
В борьбе с нефтяными загрязнениями наиболее эффективно сочетать различные методы утилизации. Перспективным направлением в данной области является сочетание био- и фиторемедиации, т.е. применение растительно-микробных ассоциаций. Так же ввиду несовершенств существующих методов ликвидации нефтезагрязнений а так же многообразия климатических зон, в которых произошло загрязнение, вопрос о создания нового биопрепарата для конкретного региона является наиболее актуальным
Актуальность темы выпускной квалификационной работы обусловлена необходимостью очистки окружающей среды от нефтезагрязнений.
Слайд 4
Целью настоящей работы являлась отработка основных этапов приготовления биопрепарата и разработка способа применения биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации.
Слайд 5
Для решения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
1 Теоретически изучить основную схему приготовления биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации.
2 Освоить процесс глубинного культивирования и концентрирования исследуемых микроорганизмов. Отработать схему инокуляции клеток исследуемых микроорганизмов на носитель.
3 Определить дозу внесения биопрепарата на единицу площади нефтезагрязненной почвы.
4 Определить степень деградации нефти в почве с помощью растительно-микробной ассоциации.
Слайд 6
Биопрепарат на основе растительно-микробной ассоциации, включает в себя иммобилизованные на семенах нефтетолерантного растения семейства бобовых Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) клетки микроорганизма-нефтедеструктора Pseudomonas delhiensis B-11400 и клетки ризобий-симбионтов Rhizobium lotus RL-5. Биопрепарат предназначен для восстановления нефтезагрязненной почвы.
Слайд 7
Оценка культуральных и морфологических свойств микроорганизмов штамма Pseudomonas delhiensis B-11400, а так же внешний вид колоний на плотной питательной среде и результат окраски по Граму представлены на слайде.
Слайд 8
Оценка культуральных и морфологических свойств микроорганизмов штамма Rhizobium lotus RL-5, а так же внешний вид колоний на плотной питательной среде и результат окраски по Граму представлены на слайде.
Слайд 9
Важным этапом в процессе приготовления биопрепарата является проведение глубинного периодического культивирования микроорганизмов. Для достижения данной цели использовали биореактор типа LiFlus GX производства Bio-Tron Inc (Южная Корея), представленного на слайде.
Слайд 10
В качестве параметров аппаратного культивирования использовали результаты выращивания микроорганизмов в жидкой среде на шейкер – инкубаторе в колбах и характеристики ферментера.
Процесс культивирования вели при следующих параметрах: температура (28±1)˚С; продолжительность – 24 ч; скорость перемешивания 450 об/мин; рН 6-8-7,0 (поддерживали автоматически с помощью добавления в среду 12%-ного раствора аммиака); аэрация – 3 л/мин в первые 4 ч роста, а затем – 6 л/мин. Источник углерода – глюкоза, ростстимулирующая добавка - салицилат натрия, который вносили в биореактор через 4 ч после начала культивирования.
На рисунке представлена зависимость роста клеток от времени культивирования.
Слайд 11
Установлено, что выбранные условия и режимы выращивания в биореакторе обеспечивают получение микробной культуры с типичными по морфологии клетками штамма, в количествах, достаточных для ее использования в дальнейшей работе на этапах приготовления биопрепарата, а, именно в процессе концентрирования. Максимальный выход биомассы составил 12,4 млрд/мл по биологической концентрации.
Слайд 12
Глубинное периодическое культивирование штамма Rhizobium lotus RL-5 вели при тех же условиях на жидкой питательной среде на основе маннитно-дрожжевого агара.
На рисунке представлена зависимость роста клеток от времени культивирования.
Слайд 13
Максимальный выход биомассы клеток штамма Rhizobium lotus RL-5 составил 15,20 млрд/мл по биологической концентрации.
Слайд 14
Концентрирование микробных культур исследуемых микроорганизмов проводили одним из наиболее прогрессивных методов в данной области, а именно ультрафильтрацией с использованием установки «Сартокон-мини». Система подключения биореактора к установке «Сартокон-мини» представлена на слайде.
Концентрирование проводили при Рвх = 3,1 bar, Р вых = 2,5 bar, при скорости потока v = 3,6 л/ч.
Слайд 15
Был получен 1 дм3 концентрированной суспензии штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 с характеристикой, представленную в таблице. максимальное содержание микробов составило 49,7 млрд м.кл./мл.
Внешний вид экспериментального образца микробного концентрата штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 представлен на слайде.
Слайд 16
Концентрирование биомассы микроорганизмов штамма Rhizobium lotus RL-5 вели при тех условиях. Был получен 1 дм3 концентрированной суспензии с максимальным содержанием микробов 48,81 млрд м.кл./мл.
Внешний вид экспериментального образца микробного концентрата штамма Rhizobium lotus RL-5 представлен на слайде.
Слайд 17
Был отработан основной метод инокуляции клеток исследуемых микроорганизмов на носителе – семенах растения семейства бобовые Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Количество жизнеспособных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составило 9,3 млрд.ж.м.к/г, Rhizobium lotus RL-5 – 5,9 млрд.ж.м.к/г по биологической концентрации соответственно. Экспериментальный образец биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации представлен на слайде.
Слайд 18
Для проведения исследований по интенсификации процесса нефтедеструкции использовали дерново-подзолистую почву, помещенную в пластиковые кюветы. Подготовленные пластмассовые кюветы объемом 500 мл и общей площадью 128,3 см2 засыпали почвой. Количество вносимых семян на одну кювету (1 опытный образец) рассчитывали исходя из общепринятых данных – 10 кг семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) на 1 га земли, соответственно, масса необходимых на один опыт составила – 0,1 г (от 15-35 семян). Экспериментальные образцы представлены на слайде.
Слайд 19
Оценка влияния нефтяного загрязнения на рост и развитие микроорганизмов и используемых растений оценивали в уловиях климатической камеры, в которой поддерживался на постоянном уровне световой период – 18 часов, влажность – 80%, рН – 6.8-7.2, температура –25˚С, аэрация. Продолжительность опыта составила 10 суток. Контрольные измерения на выявление роста семян осуществляли каждые 24 часа.
Слайд 20
Результаты фиксировали на 10 сутки эксперимента, измерили высоту ростков, также определили массу растений на лабораторных аналитических весах, длину корневой и надземной части. Зависимость роста вегетативной массы растений от степени загрязнения почвы представлена на слайде. На основании полученных результатов, можно сделать вывод, что растительно-микробная ассоциация (опытный образец №7), включающая иммобилизованные на семенах микроорганизмы Rhizobium lotus и Pseudomonas delhiensis B-11400 более эффективно произрастает на нефтезагрязненной почве. Это может объясняться тем, что нефтеокисляющие бактерии способствовали более эффективному процессу азотфиксации клубеньковых бактерий за счет мобилизации труднодоступных соединений, а также ускоряли процесс накопления биомассы растением. Микроорганизмы рода Rhizobium в свою очередь непосредственно взаимодействовали с растением, стимулируя его питание и поступление веществ, главным из которых является азот.
Слайд 21
Нефтеокисляющую активность растительно-микробной ассоциации оценивали методом определения остаточной концентрации нефтепродукта в среде (почве). Измерения проводили с помощью прибора АН-2 (анализатор нефти). Представленная диаграмма, отображает степень деградации нефти в почве при различной ее концентрации (1, 3, 5%). Ссылаясь на представленные в таблице и диаграмме данные, отчетливо видно, что в опытном образце №7, который предусматривал предпосевную обработку семян Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) консорциумом микроорганизмов наблюдается наибольший процент деградации нефти и составляет 75,89%. Это свидетельствует о том, что биопрепарат на основе растительно-микробной ассоциации является эффективным в отношении ремедиации нефтезагрязненных почв.
Слайд 22
1. Отработана схема приготовления биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, схема инокуляции клеток микроорганизмов на носитель естественного происхождения – семена Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Установлены совпадающие моменты при проведении глубинного периодического культивирования исследуемых микроорганизмов: рН 6,8-7,2 ед., 28˚ С
2. Проведено глубинное периодическое культивирование исследуемых микроорганизмов; получены культуральные среды в объеме 2,5 дм3 для каждого микроорганизма. Конечная концентрация микробных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составила 12,4 млрд ж.м.к/мл, Rhizobium lotus RL-5 – 15,2 млрд ж.м.к/мл.
3. Освоен процесс приготовления концентрированной суспензии исследуемых микроорганизмов; объем полученных концентратов составил 1дм3 для каждого микроорганизма, содержание микробных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составило 49,7 млрд ж.м.к/мл, Rhizobium lotus RL-5 – 48,81 млрд ж.м.к/мл
Слайд 23
4. Отработан основной метод инокуляции клеток исследуемых микроорганизмов на носителе – семенах Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus). Концентрация жизнеспособных клеток штамма Pseudomonas delhiensis B-11400 составила 9,3 млрд ж.м.к/г, Rhizobium lotus RL-5 – 5,9 млрд ж.м.к/г.
5. Установлена оптимальная доза внесения биопрепарата на единицу нефтезагрязненной площади в условиях эксперимента: 0,1 г (15-35 семян) на 128 см2.
6. Выявлены факторы, оказывающие влияние на степень разложения углеводородов в почве с помощью растительно-микробной ассоциации: влажность почвы, продолжительность нахождения и концентрация токсиканта в составе почвы.
7. Определено, что растительно-микробная ассоциация способна интенсифицировать деградацию нефти в почве при ее концентрации 1%, 3% и 5%. Наивысшая степень деструкции нефти в почве была при ее концентрации 1% и через 10 сутки составила 76 %, что на 26 % выше по сравнению с необработанными семенами растений
Слайд 24
Оформить результаты исследований по созданию биопрепарата на основе растительно-микробной ассоциации, включающей иммобилизованные на семенах нефтетолерантного растения семейства бобовые Лядвенца рогатого (Lotus corniculatus) клеток микроорганизмов нефтедеструкторов Pseudomonas delhiensis B-11400 и клетки ризобий-симбионтов Rhizobium lotus RL-5 в виде нормативного документа, регламентирующего его производство и контроль.
Результаты исследований опубликованы в материалах Всероссийской ежегодной научно-практической конференции «Общество, наука, инновации» в 2015-2016 гг., г. Киров, конференции «Биология – наука 21 века», 2015-2016 гг., г. Пущино.
Слайд 25
Автор выражает глубокую благодарность за помощь в подготовке к защите научному руководителю к.б.н., доценту Лазыкину Алексею Геннадьевичу, заведующему кафедрой, д.м.н., профессору Дармову Илье Владимировичу и всем сотрудникам кафедры Микробиологии ВятГУ.
Слайд 26
Доклад окончен. Спасибо за внимание.

Приложенные файлы

  • docx 26564944
    Размер файла: 3 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий