Лаб №1-4


Розділ 1
Хімія білків
Лабораторна робота № 1
Прості білки. Якісні кольорові реакції на функціональні групи білків та амінокислот.
1.1 Мета: оволодіти методикою проведення якісних реакцій на функціональні групи білків та амінокислот.
1.2 Короткі теоретичні відомості
Б і о х і м і я — наука, що вивчає склад та структуру хімічних речовин живої матерії, їх перетворення та фізико-хімічні процеси, які лежать в основі життєдіяльності.
Біохімія широко використовує хімічні, фізичні, фізико-хімічні та біологічні методи дослідження, проте має і свої, наприклад ферментативні, які в свою чергу широко використовуються в харчовій промисловості і аграрному секторах економіки, медицині і фармації.
До складу живих організмів входять білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи, ліпіди, продукти їх проміжного і кінцевого обміну, різні біологічно активні речовини (вітаміни, гормони, медіатори та інші), вода і неорганічні іони.
Білки — високомолекулярні нітрогеновмісні органічні сполуки, побудовані з великої кількості залишків амінокислот, з’єднаних між собою пептидними (кислотно-амідними) зв’язками в поліпептидний ланцюг (ланцюги), що мають складну структурну (просторову) організацію та виконують важливі життєві функції.
Їм належить першочергова роль у структурній організації і функціонуванні живих організмів. Білки є основними структурними компонентами живих організмів і в кількісному відношенні посідають перше місце серед усіх макромо-лекул, які містяться в живій клітині. В організмі тварин білків міс-титься від 40 до 50% і більше від сухої маси, менше у рослин – до 20– 30%. У тканинах ссавців білки складають – 18–20%, тоді як нуклеїнові кислоти, вуглеводи, ліпіди – 1–15%. Суха маса організму людини скла-дається на 45-50% із білків, при цьому їх вміст досягає: у м'язах – 80%, у серці – 60%, печінці – 72%, легенях – 82%, нирках – 72%, селезінці – 84%, у кістках – 28%.
На сьогодні досягнуто значних успіхів у розкритті структури великої кількості білків, у вивченні взаємозв'язку структури і функції білків, механізму їх участі у найважливіших процесах життєдіяльності організму, у розумінні основ патогенезу багатьох хвороб. Білки мають велике народногосподарське значення. Вони є найважливішими компонентами їжі людини і сільськогосподарських тварин. Хронічна нестача білків призводить до різноманітних захворювань, зменшуючи тим самим середню тривалість життя.
У складі природних білків зустрічається близько 20 різних ,L -амінокислот. Усі амінокислоти, що входять до складу білка (протеїногенні амінокислоти), є амінопохідними карбонових кислот, в яких один атом гідрогену в радикалі при -карбоновому атомі заміщено на аміногрупу. Наприклад:
101219050165
Залежно від природи радикалу розрізняють амінокислоти аліфатичного (жирного) і циклічного рядів, причому останні можуть бути як ароматичними, так і гетероциклічними сполуками.
Одна з найважливіших властивостей амінокислот – це їх здатність вступати в реакцію поліконденсації з виділенням молекули води і утворенням ковалентного пептидного зв’язку; в реакції беруть участь тільки функціональні групи сусідніх амінокислот. Наприклад:

Пептидний зв’язок можна розглядати як амідний, в якому один із Н-атомів є заміщеним. До дипептиду аналогічним чином можуть приєднуватися інші амінокислоти з утворенням три-, тетра-, пента- і так далі, аж до крупного поліпептиду – білка. Оскільки в складі пептидів амінокислоти перебувають у формі ацилів, то в назві пептидів вони отримують характерні для ацилів суфікси «іл» замість «ін» або «н», відповідних амінокислот, а саме: «Аланіл» замість «Аланін», «Гістидил» замість «Гістидин» і т. д. Назва С-кінцевої амінокислоти з вільною СООН-групою не змінюється.
Різноманітність біохімічних функцій білків пов’язана з особливостями їх хімічної будови, яка визначається якістю, кількістю амінокислотних залишків і порядком їх чергування в поліпептидному ланцюгу.
Білкам належить першочергова роль у структурній організації і функціонуванні живих організмів.
У харчовій промисловості широко використовуються речовини білкової та пептидної природи (ферменти, білкові продукти харчування, харчові і кормові добавки та інші); гідролізати тканинних білків; суміші індивідуальних амінокислот; амінокислоти (цистеїн, гістидин, глутамінова кислота, метіонін та інші); похідні амінокислот (ацетилцистеїн, цистамін та інші.
Існують дві різновидності кольорових реакцій:
універсальні – біуретова (на всі білки) і нінгідринова (на всі α-амінокислоти та білки);
специфічні — тільки на деякі амінокислоти як в молекулі білка, так і в розчинах окремих амінокислот.
Радикали амінокислот дають різноманітні забарвлення, що зумовлює можливість виявлення більшості з них певними кольоровими реакціями.
Кольорові реакції широко використовуються для виявлення білкової природи речовин, вивчення амінокислотного складу різних природних білків і пептидів, для ідентифікації індивідуальних амінокислот. Багато з них є досить чутливими та високо специфічними, що дозволяє відкривати незначні кількості білків, тієї чи іншої амінокислоти в продуктах харчування, у гідролізатах білків, які використовуються в харчовій промисловості.
1.3 Експериментальна частина
1.3.1 Біуретова реакція на пептидну групу (реакція Піотровського).
Біуретова реакція зумовлена наявністю в молекулах білків пептидних зв’язків. У лужному середовищі в присутності йонів двовалентного купруму розчини білків і пептидів набувають фіолетового забарвлення з червоним або синім відтінком залежно від кількості пептидних зв'язків. У сильно лужному середовищі пептидні групи поліпептидних ланцюгів переходять в енольну форму, яка взаємодіє з йонами Сu2+ і утворює забарвлений біуретовий комплекс:
При цьому енольна форма поліпептиду, утворена в сильно-лужному середовищі, дає негативний заряд, та її оксиген, що взаємодіє з купрумом, утворює ковалентний зв'язок, а при взаємодії з атомами нітрогену, купрум утворює координаційні зв'язки. Таку реакцію дають усі білки, а також пептиди, що містять не менше двох пептидних зв'язків. З ди- та трипептидами забарвлення нестійке. Біуретову реакцію дають також біурет, деякі амінокислоти (гістидин, серин, треонін, аспарагін) та інші сполуки при досить значній концентрації в розчині. Деякі кислоти, у яких пептидні зв'язки виникають за рахунок карбоксильної та амінної груп (аспарагін) дають біуретову реакцію.
Біурет, що дав назву цій реакції, утворюється при сплавленні двох молекул сечовини:

У три пронумеровані пробірки вносять по 1 мл: 1 % розчину яєчного білка; 1 % розчину желатини; 0,1 % розчину амінокислоти гліцину чи аланіну. Добавляють в кожну пробірку по 1 мл біуретового реактиву, ледь збовтують. Спостерігають, чи утворюватиметься синьо–фіолетове забарвлення, дають пояснення (по кожній пробірці) і роблять висновки.
1.3.2 Нінгідринова реакція на α-аміногрупуБілки, пептиди, вільні α-амінокислоти дають синє або синьо-фіолетове забарвлення при взаємодії з нінгідрином (трикетогідринденгідратом). Реакція характерна для аміногруп, що знаходяться в -положенні. α-Амінокислоти при нагріванні до 70°С з нінгідрином перетворюються на альдегіди з виділенням амоніаку і вуглекислоти. Нінгідрин при цьому відновлюється:
Відновлений нінгідрин конденсується з амоніаком та окисненим нінгідрином і утворює сполуку, яка єнолізується і переходить у забарвлену форму, що має синьо-фіолетовий колір:
Нінгідринова реакція з використанням спиртового (або ацетонового) розчину широко використовується в хроматографічному аналізі, а також для колориметричного кількісного визначення, амінокислот (цистеїн, метіонін, глутамінова кислота, гістидин; амінокислот у гідролізатах білків).
В одну пробірку наливають 1 мл 1 % -вого розчину яєчного білка, в другу — 1 мл 0,1 % -вого розчину α-аланіну і в третю –1 мл 0,1% -вого розчину β-аланіну. Приливають у всі пробірки по 5-10 крапель 0,5 % -вого водного розчину нінгідрину і нагрівають на водяній бані при температурі 70°С протягом 5 хв. Спостерігають за утворенням забарвлення, порівнюють швидкість утворення забарвлення в кожній пробірці, дають пояснення та записують хімізм реакції.
1.3.3 Ксантопротеїнова реакція на ароматичне кільце циклічних амінокислот (реакція Мульдера).
При взаємодії з концентрованою нітратною кислотою білки, пептиди, що містять залишки циклічних амінокислот з ароматичними кільцями (фенілаланін, тирозин, триптофан), а також вільні вище вказані амінокислоти нітруються з утворенням динітропохідних жовтого кольору, які при додаванні лугу перетворюються на хіноїдні структури, забарвлені в оранжевий колір:

Фенілаланін нітрується важче. Білки, що не містять циклічних амінокислот, не дають ксантопротеїнової реакції.
В одну пробірку наливають 1 мл 1 % -вого розчину яєчного білка, в другу – 1мл 0,1 % -вого розчину тирозину, в третю – 1 % -вого розчину желатини, в четверту – 1 мл 0,1% -вого розчину гліцину. Додають до всіх пробірок по 1 мл концентрованої нітратної кислоти і обережно нагрівають до появи жовтого забарвлення. Потім пробірки охолоджують під струменем водопровідної води, додають краплинами 20 % -вий розчин натрію гідроксиду, доки не почнеться зміна забарвлення. Дають пояснення результатам досліду в кожній пробірці, порівнюють забарвленя і записують хімізм реакції.
1.3.4 Реакція на тирозин (реакція Міллона).
Амінокислота тирозин і білки, що її містять, при нагріванні з реактивом Міллона (суміш меркурію нітратів і нітритів, розчинених в концентрованій нітратній кислоті) утворюють меркурієву сіль динітротирозину, забарвлену в пурпурово-червоний колір. Ця реакція не є абсолютно специфічною для тирозину, її дають феноли, поліфеноли, а також алкалоїди, що мають фенольну групу:
4572002540
В одну пробірку наливають 1 мл 1 % -вого розчину яєчного білка, в другу – 1 мл 0,1 %-вого розчину тирозину і в третю – 1 мл 0,1 %-вого розчину фенілаланіну. Додають у всі пробірки по 3 краплі реактиву Міллона і обережно нагрівають на водяній бані (не вище 50°С). Утворюється меркурієву сіль динітротирозину, забарвлену в пурпурово-червоний колір. Дають пояснення і записують хімізм реакції.
1.3.5 Реакція на гістидин.
Розчин гістидину значної концентрації в лужному середовищі в присутності купруму сульфату дає фіолетове забарвлення, що переходить у червоно-фіолетове:

Принцип цієї реакції використовується у фармацевтичному аналізі для ідентифікації фармпрепарату «Гістидину гідрохлорид» та його 4 % -вого розчину для ін'єкцій в ампулах.
До 0,5 мл 4 % -вого розчину гістидину приливають 1,5 мл води, 0,5 мл 10 %-вого розчину натрію гідроксиду і нагрівають до кипіння. До гарячого розчину додають краплю 10 % - вого розчину купруму сульфату (біуретова реакція). Спостерігають за утворенням забарвлення і записують хімізм реакції.
1.3.6 Реакція на аргінін (реакція Сакагучі).
Амінокислота аргінін та поліпептиди, що містять її, окиснюються в лужному середовищі натрію гіпобромітом і в присутності α-нафтолу утворюють продукт конденсації червоного кольору (реакція на гуанідинове угруповання). Реакція не є строго специфічною для аргініну, її дають і інші монозаміщені гуанідину (метилгуанідин, глікоциамін, агматин та інші), але вони відсутні в молекулі білка і не заважають визначенню аргініну:


В одну пробірку вносять 1 мл 1 %-вого розчину яєчного білка, в другу — 1 мл 0,01 %-вого розчину аргініну. У кожну пробірку додають 1 мл 10 % -вого розчину натрію гідроксиду і по 3 краплі 0,2 % -вого спиртового розчину -нафтолу, ретельно перемішують вміст пробірок, додають по 1 мл 2 %-вого розчину натрію гіпоброміту. Спостерігають за утворенням забарвлення (для стабілізації кольору рекомендується додати 0,5 мл 40 % -вого розчину сечовини) і записують хімізм реакції.
1.3.7 Реакція на триптофан (реакція Адамкевича).
Амінокислота триптофан і білки, що її містять, у кислому (лужному) середовищі реагують з гліоксиловою кислотою (альдегідами), утворюючи продукт конденсації червоно-фіолетового кольору:
19431035560
У першу пробірку наливають 1 мл нерозведеного білка, в другу – 1 мл 0,1 %- ного розчину триптофану. У кожну пробірку додають по 0,5 мл концентрованої оцтової кислоти (яка містить незначну кількість гліоксилової кислоти). Отриману суміш спочатку нагрівають до розчинення осаду, а потім охолоджують після чого обережно, по стінкам пробірки, щоб рідини не перемішалися, додають 1 мл концентрованої сульфатної кислоти. Через 10 хв спостерігають утворення червоно-фіолетового кільця на межі двох шарів. Реакцію можна прискорити, помістивши пробірку із реагуючою сумішшю у киплячу водяну баню. Спостерігають за утворенням забарвленого кільця на межі двох рідин, дають пояснення, записують хімізм реакції. Реакцію можна прискорити, поставивши пробірку в киплячу водяну баню. Чутливість реакції збільшується, якщо в реагуючу суміш додати п’ять крапель 0,04 моль/л купруму (ІІ) сульфату.
1.3.8 Реакція на амінокислоти, що містять слабозв'язаний сульфур
(реакція Фоля).
Сульфгідрильні групи (—SН) у білку, пептиді, а також амінокислоти цистеїн і цистин в результаті лужного гідролізу при нагріванні утворюють натрію сульфід, який з натрію плюмбітом дає чорний або бурий осад плюмбуму сульфіду:
496570103505

Pb(CH3COO)2 +2NaOH Pb(OH)2 + 2CH3COONa
Pb(OH)2 + 2NaOH Na2PbO2 + 2H2O
Na2S + Na2PbO2 + H2O PbS + 4NaOH
Метилтіогрупа метіоніну більш стійка, тож при слабкому гідролізі не руйнується і цієї реакції не дає. Деякі білки практично не містять сульфуровмісних амінокислот, наприклад желатин.
Для виявлення сульфуру 0,05г метіоніну сплавляють з 30 % -вим розчином натрію гідроксиду. Відбувається руйнування молекули молекули метіоніну з утворенням похідних меркаптану і сульфідів:
401955146685

Утворені сульфіди можна виявити кольоровою реакцією з розчином натрію плюмбіту або нітропрусиду.
У три пронумеровані пробірки вливають по 10 крапель 5 % -вого розчину плюмбуму ацетату і краплями додають 20 % -вий розчин натрію гідроксиду до розчинення попередньо утвореного осаду. Потім у першу пробірку додають 1 мл 1 % розчину яєчного білка, у другу – 1 мл 1 % розчину желатини, у третю — 1 мл 0,1 %-вого розчину цистеїну гідрохлориду, у четверту – 1 мл 0,1 % розчину метіоніну. Суміші кип'ятять. Спостерігають за перетворенням забарвлення в кожній пробірці, дають пояснення і записують рівняння хімічної реакції.
1.3.9 Нітропрусидна реакція на сульфуровмісні амінокислоти.
В одну пробірку вносять 1 мл нерозведеного свіжого яєчного білка, у другу — 1 мл 0,1 %-вого розчину цистеїну гідрохлориду, у третю — 1 мл 0,1 %-вого розчину метіоніну. Приливають у всі пробірки по 1 мл 20 %-вого розчину натрію гідроксиду, кип'ятять 3 хв, охолоджують і вносять 2—3 краплі 5 % -вого розчину натрію нітропрусиду. Спостерігають за появою забарвлення, дають пояснення і записують хімізм реакції.
Натрію сульфід, утворений при лужному гідролізі білків і сульфуровмісних амінокислот, дає з натрію нітропрусидом комплексну сполуку червоно-фіолетового кольору:

1.4 Питання для самоконтролю
(домашнє завдання).
Дайте визначення білків.
Чим обумовлені кольорові реакції на білки?
Якщо з розчином одного білка реакції Міллона та ксантопротеїнова позитивні, а з розчином другого негативні, то що можна сказати про відмінність амінокислотного складу цих білків?
Як за допомогою кольорових реакцій виявити в білку аргінін, цистеїн?
Дані пептиди:
Асп-Фен-Мет-Гис-Цис-АлаТир-Цис-Про-Арг-Глу.
Які кольорові реакції будуть позитивні з цими пептидами? Обгрунтуйте ваш вибір.
За допомогою яких кольорових реакцій можна встановити відмінність
амінокислотного складу альбуміну й желатину?
7. Дани дві пробірки з розчинами: одна з розчином білка, друга вміщує суміш амінокислот. За допомогою кольорових реакцій визначити:
а) в якій пробірці міститься білок?
б) які амінокислоти містяться в другій пробірці?
Лабораторна робота № 2
Властивості амінокислот, методи виділення і кількісного визначення.
2.1 Мета: вивчити амфотерні властивості амінокислот, оволодіти методикою виділення та кількісного визначення білків та вільних амінокислот із біологічного матеріалу.
2.2 Короткі теоретичні відомості
Амінокислоти — це нітрогенвмісні карбонові кислоти, тобто хімічні сполуки, молекула яких одночасно містять аміногрупу -NH2 та  HYPERLINK "http://uk.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%B0%D1%80%D0%B1%D0%BE%D0%BA%D1%81%D0%B8%D0%BB%D1%8C%D0%BD%D0%B0_%D0%B3%D1%80%D1%83%D0%BF%D0%B0" \o "Карбоксильна група" карбоксильну групу -СООН, і карбоновий скелет.
В залежності від положення аміногрупи розрізняють амінокислоти, тощо. Найбільш важливе значення мають амінокислоти, які входять до складу білків. В загальному вигляді формулу амінокислоти можна представити наступним чином:

Амінокислоти проявляють амфотерні властивості оскільки вміщують як основну групу -NH2, так і кислотну групу -СООН. Амфотерність амінокислот проявляється, наприклад, при утворенні внутрішніх солей, так званих біполярних йонів:
H2N-CH2-COOH → H3N+-CH2-COO
Амінокислоти реагують як з лугами, так і з кислотами:


Вільні амінокислоти екстрагують із біологічного матеріалу 75-80%-вим водним розчином етанолу. Амінокислоти у витяжці визначають за допомогою реакції з нінгідрином.
Кількісне визначення амінокислот методом формольного титрування за Серенсеном. Метод використовують для визначення карбоксильних груп амінокислот. Визначаючи кількість карбоксильних груп формольним титруванням, одночасно можна встановити наявність амінних груп, тому що кількість карбоксильних груп, що титруються лугом, еквівалентна кількості зв’язаних формальдегідом амінних груп.
Для кількісного визначення білків у біологічному матеріалі найчастіше застосовують фотоколориметричні і спектрофотометричні методи, у деяких випадках використовують визначення білка за вмістом загального нітрогену (азотометрія), а також фотонефелометричні методи.
Кількісні методи визначення білків використовують у практиці для контролю білкових препаратів, а також для визначення активності ферментних препаратів. Методи кількісного визначення білка займають значне місце в науково-дослідних експериментах.
У клініко-біохімічних лабораторіях для встановлення діагнозу багатьох захворювань проводять визначення концентрації білків в біорідинах організму (крові, сечі, спинномозковій рідині, ексудатах). У сироватці крові міститься суміш білків, різних за фізіологічним значенням, структурою і фізико-хімічними властивостями. На сьогоднішній день знайдено близько 100 різних білків плазми крові. У нормі вміст загального білка в сироватці крові дорівнює у дорослих 65—85 г/л (6,5—8,5 г %), у дітей до 6 років 56—85 г/л або 5,6—8,5 г %.
Збільшення рівня концентрації білка до 120 г/л (гіперпротеїнемія) зустрічається рідко. Це характерно для деяких хронічних запальних процесів унаслідок утворення антитіл (поліартрит, ревматизм, мієломна хвороба — плазмоцитома). Короткочасна відносна гіперпротеїнемія відзначається при згущенні крові, унаслідок значних втрат рідини, наприклад, при посиленні потовиділення, невтримному блюванні, холері, нецукровому діабеті, тяжких опіках і т. д. Пониження кількості білка (гіперпротеїнемія) має місце при недостатньому надходженні білка з їжею (голодування, порушення прохідності кишечного тракту); порушенні процесів біосинтезу білків в органах; ураженні печінки хімічними речовинами, мікроелементами, пухлинами; втраті білка організмом (кровотечі, підвищеній проникності судин, хворобах нирок, вагітності і т. д.).
Колориметричні методи визначення кількості білка.
Вони базуються на так званих «кольорових» реакціях на функціональні групи білків (див. роботу 1). При визначенні білка в лікарських препаратах заздалегідь будують калібрувальний графік з використанням стандартного зразка білка (сироваткового альбуміну людини, сироваткового альбуміну бика або амінокислоти тирозину).
Спектрофотометричні методи кількості визначення білка. Спектрофотометричні методи розділяють на прямі й непрямі. Останні є більш чутливим і точним варіантом фотоколориметричного. Як було зазначено раніше, після проведення кольорової реакції на білки проводять спектрофотометрію забарвленого розчину і за його світлопоглинанням у монохроматичному світлі розраховують вміст білка. Прямий метод полягає в вимірюванні світлопоглинання розчину білка в ультрафіолетовій ділянці при 200—220 нм (у цій ділянці поглинають пептидні групи білка) і при 280 нм (зона поглинання ароматичних радикалів амінокислот, в основному триптофану і тирозину). Ці методи досить зручні і не потребують попереднього утворення забарвлених комплексів.
Визначення кількості білка за вмістом білкового нітрогену.Вміст нітрогену в більшості білків практично близький і може сягати 16 %. Знайдену кількість нітрогену помножують на 6,25 (тому що 100 :16 = 6,25) і одержують вміст білка в пробі. У тому випадку, якщо біологічний матеріал, крім білка, містить інші речовини, до складу яких входить нітроген, білок попередньо осаджують трихлороцтовою або перхлоратною кислотою. При нагріванні білка з концентрованою сульфатною кислотою відбувається його мінералізація, нітроген переходить до амонію сульфату, і його можна визначити кількісно. Ці методи (мікрометод К'єльдаля і його модифікація) досить складні в роботі, не завжди надійні, оскільки вміст нітрогену в різних білках коливається від 14 до 19 %.
2.3 Експерементальна частина

2.3.1 Амфотерні властивості α–аланіну.
Аланін у водному розчині існує у формі біполярного йона і виявляє кислотні і основні властивості:
153670057785
У дві пробірки вносять по 0,5 мл краплин розчину α –аланіну. В одну з них додають, струшуючи, по краплинам 0,01 моль/л розчин хлоридної кислоти, підфарбований індикатором конго в синій колір (кисле середовище) до появи рожево-червоного кольору (лужне середовище). В іншу пробірку, постійно струшуючи, додають по краплинам 0,01 моль/л розчин гідроксиду натрію, підфарбований фенолфталеїном у рожевий колір (лужне середовище) до зникнення забарвлення (кисле середовище).
2.3.1 Виділення вільних амінокислот із біологічного матеріалу.
У ступку вміщують 2 г розмолотого сухого біологічного матеріалу та заливають 10 мл 75%-вого розчину етилового спирту, нагрітого до 60-700С на водяній бані. Отриману суміш розтирають протягом 15 хвилин і фільтрують через вставлений у лійку складчастий паперовий фільтр в чашку для випарювання, використовуючи її як приймач. Чашку ставлять на киплячу водяну баню та повністю випарюють спирт. Отриманий сухий залишок розчиняють в 1 мл 1 % розчину соляної кислоти та перемішують скляною паличкою протягом 10-15 хвилин.
Для виявлення амінокислот у витяжці до 5 краплин суміші додають 2 мл дистильованої води і 3- 4 краплини розчину нінгідрину. Суміш перемішують і нагрівають на водяній бані при 700С протягом 5 хвилин. Поява синьо-фіолетового забарвлення, засвідчує про наявність в пробі α-амінокислот.
Якщо густину забарвлення витяжки із нінгідрином виміряти за допомогою колориметра і співставити з густиною забарвленням нінгідрином суміші α-амінокислот відомої концентрації, то можна розрахувати концентрацію α-амінокислот у досліджуваній пробі.
2.3.2 Кількісне визначення амінокислот методом формольного титрування за Серенсеном.
Метод грунтується на здатності амінокислот реагувати з нейтральним розчином формальдегіду з утворенням метиленамінокислот. Цей метод застосовується для визначення карбоксильних груп амінокислот, які титрують розчином лугу, попередньо блокуючи аміногрупи формальдегідом. Під час реак-ції з формальдегідом аміногрупа втрачає основні властивості, вна-слідок чого утворюється метиленамінокислота, яка відтитровується лугом:

Визначаючи кількість карбоксильних груп титруванням, можна одночасно встановити й вміст α -аміногруп, оскільки кількості карбоксильних груп і зв'язаних формальдегідом α -аміногруп еквівалентні.
До 25 мл 1 %-ної суміші амінокислот (витяжка амінокислот із біологічного матеріалу) в колбі додають 1г барію хлориду, 10 крапель розчину фенолфталеїну та перемішують. До суміші приливають насичений розчин баритової води до появи рожевого відтінку. Колбу закривають і залишають на 15 хв. Потім об’єм доводять водою до 100 мл та відфільтровують через складчастий паперовий фільтр від фосфорнокислих і вуглекислих солей барію. Готують дві колби на 100 мл. В одну вносять 40 мл фільтрату, що відповідає 10 мл розчину амінокислот, в іншу – 40 мл дистильованої води. Додають по 10 крапель розчину фенолфталеїну і 0,01 моль/л розчин хлоридної кислоти (обережно) до забарвлення розчинів (проби і контролю) у ледь помітний рожевий колір. У кожну колбу додають по 10 мл формольной суміші і титрують з бюретки 0,05 M розчином гідроксиду калію до появи рожевого кольору. Колір проби і контролю повинен бути однаковий.
Масову концентрацію амінокислот (мг/мл) визначають за формулою:
С = (А-В)fQ/V,
де А і В – об’єми розчину гідроксиду калію, витрачені на титрування проби і контролю (мл); f - коефіцієнт поправки на титр 0,05 моль/л розчину гідроксиду калію; Q - маса амінокислот, еквівалентна 1 мл 0,05 моль/л розчину гідроксиду калію (0,7 мг); V – об’єм розчину амінокислоти взятої для аналізу.
2.3.3 Колориметричні методи визначення кількості білка.
2.3.3.1.Визначення кількості білка за біуретовою реакцією. Серед різних
методів визначення білка особливого розповсюдження набув метод, що базується на біуретовій реакції (див. роботу 1, А). Він характеризується специфічністю визначення (оскільки пептидні зв'язки мають тільки білки і пептиди), точністю і доступністю. Біуретову реакцію не можна проводити в присутності солей амонію через утворення мідно-амоніачних комплексів.
Визначення проводять таким чином: 1 мл досліджуваного препарату, що містить 1–10 мг білка, поміщають у пробірку, додають 4 мл біуретового реактиву, перемішують і залишають на 30 хв при кімнатній температурі. Оптичну густину розчину вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі в діапазоні від 540 до 650 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. Розчином порівняння є суміш цих же реактивів без препарату. Калібрувальний графік будують в межах концентрації від 1 до 10 мг стандартного зразка білка, вимірюючи оптичну густину розчинів при відповідній довжині хвилі.
2.3.3.2. Мікрометод визначення кількості білка з реактивом Бенедикта.
2 мл розчину препарату, що містить 0,1—2 мг досліджуваного білка, поміщають у пробірку, додають 2 мл 6 %-вого розчину натрію гідроксиду, 0,2 мл реактиву Бенедикта, перемішують і залишають на 15 хв при кімнатній температурі. Оптичну густину вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 330 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. Розчином порівняння є суміш цих реактивів без препарату. Калібрувальний графік будують у межах концентрації від 0,1 до 2 мг стандартного зразка білка, вимірюючи оптичну густину розчину при довжині хвилі 330 нм.
2.3.3.3. Визначення кількості білка за методом Лоурі. Метод грунтується на визначенні інтенсивності забарвлення, яке дає розчин білка в кольорових реакціях — біуретовій і реакції Фоліна (ароматичні амінокислоти і цистеїн). При взаємодії білка з лужним розчином купруму сульфату утворюються комплексні сполуки (біуретова реакція), які своїми тирозиновими і цистеїновими радикалами відновлюють суміш фосфатно-вольфраматної і фосфатно-молібдатної кислот з утворенням комплексної сполуки синього кольору (реактив Фоліна). Незважаючи на високу чутливість, метод Лоурі має деякі вади, оскільки цю реакцію дають і інші речовини, наприклад фенольної природи, а також вільні ароматичні амінокислоти.
Визначення проводять таким чином: 1 мл розчину досліджуваного препарату, що містить 0,025—0,250 мг білка, поміщають у пробірку, приливають 2 мл реактиву 1* і залишають при кімнатній температурі на 10 хв. Потім додають 0,5 мл реактиву Фоліна*, перемішують і через 30—40 хв вимірюють оптичну густину на спектрофотометрі при довжині хвилі 750 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. Розчином порівняння є суміш цих же реактивів без препарату.
2.3.3.4.Визначення кількості білка за методом Лоурі в модифікації Святкіна. Цей метод використовують для визначення вмісту білка в препаратах з підвищеним вмістом ліпо- і глікопротеїнів: 0,5 мл розчину досліджуваного препарату, що містить 0,50—2,5 мг білка, поміщають у пробірку, додають 0,8 мл розчину 1 моль/л натрію гідроксиду і 0,1 мл 1%-вого розчину натрію дезоксихолату, потім додають 4 мл реактиву 2*, суміш перемішують. Після прояснення розчину приливають 0,5 мл реактиву Фоліна*, негайно перемішують і залишають на 30 хв у темному місці при кімнатній температурі. Оптичну густину вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 750 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. Розчином порівняння є суміш цих же реактивів без фармпрепарату. Калібрувальний графік будують у межах концентрації від 0,5 до 2,5 мг стандартного зразка білка, вимірюючи оптичну густину розчинів при довжині хвилі 750 нм.
2.3.3.5. Визначення кількості білка за методом Флореса. Метод ґрунтується на утворенні забарвленого в синій колір комплексу білка з барвником бромофеноловим синім: 5 мл досліджуваного препарату, що містить 0,01—0,08 мг білка, поміщають в пробірку, додають 0,3 мл розчину бромофенолового синього*, витримують при кімнатній температурі впродовж однакового часу в інтервалі від 10 хв до 8 год. Комплекс стійкий протягом 8 год. Оптичну густину вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 610 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. Як розчин порівняння використовують суміш цих же реактивів без препарату. Калібрувальний графік будують у межах концентрацій від 0,01 до 0,08 мг стандартного зразка білка (майже прямолінійна залежність), вимірюючи оптичну густину розчинів при довжині хвилі 610 нм.
2.4 Питання для самоконтролю
(домашнє завдання).
1. Поясніть, чому білки лежать в основі життєдіяльності організму?
2. Від чого залежить різноманітність структури і властивостей білків?
3. Чому амінокислоти виявляють амфотерні властивості?
5. Які властивості виявляє аланін в кислому середовищі? Записати хімізм реакції.
6. Які властивості виявляє аланін в середовищі середовищі? Записати хімізм реакції.
4. Напишіть формулу тетрапептида, що утворений гліцином, аланіном, цистеїном і тирозином. Дайте йому назву.
5. Доведіть, що всі особливості будови молекули білку визначаються його первинною структурою.
6. Правила утворення пептидного зв‘язку.
7. Які методи застосовують для кількісного визначення білків?
8. На яких реакціях засновано кількісне визначення білка біуретовим методом? Методом Лоурі?
8. Який метод більш чутливий: біуретовий чи метод Лоурі?
Лабораторна робота № 3
Фізико-хімічні властивості білків
3.1 Мета: дослідити розчинність білків, навчитись визначати ізоелектричну точку білкків, проводити розділення білкових фракцій.
3.2 Короткі теоретичні відомості
Розчинність різних білків у воді і в різних розчинниках неоднакова і залежить від природи білка й розчинника, значення рН, температури, іонної сили тощо. Наприклад, альбуміни розчиняються у воді, а глобуліни – тільки в присутності електролітів, білки опорних тканин (кератини, колаген, еластин та ін.) не розчиняються у воді й сольових розчинах, у воді вони лише набрякають. Розчинність білків у воді зростає за невеликих концентрацій нейтральних солей (Na2SO4, MgSO4, (NH4)2SO4 та ін.). Цей ефект називають сольовим розчинен-ням. Нейтральні солі в малих концентраціях збільшують ступінь дисо-ціації іонізованих груп білка, екранують заряджені групи білкових мо-лекул і цим зменшують білок-білкові взаємодії. Високі концентрації нейтральних солей, навпаки, осаджують (висолюють) білки з водних розчинів; найактивніше це відбувається у ІЕТ білка. При цьому солі відтягують до себе від заряджених груп білка поляризовані молекули води і тим самим частково позбавляють білок гідратної оболонки, ко-тра запобігає його осадженню з розчину.
Різна розчинність білків використовується для їх одержання і очистки, у науково-експериментальній роботі.
Білки — амфотерні поліелектроліти, у водних розчинах мають властивості слабких кислот або слабких лугів, залежно від переваги в молекулі білка залишків моноамінодикарбонових (глутамінової і аспарагінової) кислот або залишків діаміномонокарбонових кислот. Білки кислотного характеру (альбуміни, глобуліни) у водному розчині несуть негативний заряд, білки лужного характеру (протаміни, гістони) — позитивний заряд. Наявність заряду на макромолекулі білка стабілізує його в розчині, оскільки заважає злипанню білкових частинок і випаданню їх в осад. Зміною концентрації протонів у середовищі (додаванням кислот або лугів) можна зменшити дисоціацію білкових частинок і перетворити їх на електронейтральні амфіони, тобто досягнути ізоелектричного стану білка. Концентрація йонів гідрогену, при якій білок знаходиться в ізоелектричному стані (сумарні кількості негативних і позитивних зарядів однакові), називається ізоелектричною точкою (ІЕТ) білка. ІЕТ характеризує хімічну природу білка. Для кожного білка існує своя ІЕТ. При рН, близькому до ІЕТ, розчинність, набухання, в'язкість білка стають найменшими, а осадження, аглютинація та комплексоутворення – найлегшими. Таким чином, в ІЕТ білок нестабільний і легко випадає в осад, особливо в присутності водовіднімаючих речовин (спирту, ацетону та ін.).
Знаючи ІЕТ індивідуальних білків, можна підібрати сприятливі умови для осадження їх із біологічних рідин, тканинних екстрактів, що містять суміш різних білків, а також для одержання і очистки білкових препаратів.
Висолювання білків (розділення білкових фракцій).
У водному розчині більшість білків та їх частинок заряджені і гідратовані. При додаванні великих кількостей солей лужних і лужноземельних металів (натрію сульфату, магнію сульфату, натрію хлориду та інших), а також нейтральних солей, наприклад, амонію сульфату, молекули яких у водних розчинах гідратовані, відбувається руйнування гідратної оболонки (дегідратація) білка. Крім цього, електричний заряд білкової молекули знижується йонами солі, що на ній адсорбуються, частинки білка злипаються одна з одною і випадають в осад. Таке явище називають «висолюванням» білка. При висолюванні білок не втрачає притаманних йому фізико-хімічних і біологічних властивостей. Він знову розчиняється у воді і проявляє майже з тією активністю ферментативні, антигенні, імунні та інші біологічні властивості, тобто залишається нативним (натуральним).
Білки відрізняються один від одного зарядом і гідрофільністю, тому можна розділити білки, використовуючи для їх осадження різні концентрації солей або органічних розчинників у середовищі. Таким чином, білки можна висолювати фракційно: високомолекулярні, менш гідрофільні глобуліни легше висолюються, ніж альбуміни. Глобуліни сироватки випадають вже при напівнасиченні білкових розчинів амонію сульфатом, а альбуміни — тільки при повному насиченні, тобто коли закінчується розчинення солі.
Осадження білка методом висолювання використовують для розділення білкових фракцій при отриманні очищених білків, у тому числі ферментних і гормональних препаратів, а також для одержання білків в кристалічному стані. Його використовують у клініко-біохімічних лабораторіях для розділення альбумінів і глобулінів і визначенні їх співвідношення в сироватці крові. Осаджену фракцію білка відділяють центрифугуванням, розчиняють і кількісно визначають за допомогою різних методів. У нормі альбуміно-глобулінове співвідношення (А/Г — коефіцієнт) дорівнює 1,5—2,3 і може змінюватися при патології, наприклад при хронічних дифузних ураженнях печінки (гепатит і цироз), інфекційних захворюваннях, лихоманці, пневмонії, туберкульозі, ендокардиті, злоякісних процесах, амілоїдозі, при збільшенні вмісту глобулінів.
Діаліз білків. Діалізом називається особливий вид розділення речовин за допомогою мембран, які не здатні пропускати через свої пори високомолекулярні колоїдні частинки. Молекули білків не проходять через напівпроникні мембрани (наприклад: целофан, пергамент, висушені плівки колодію та ін.). Тому діаліз є зручним методом очищення білка від низькомолекулярних органічних і неорганічних домішок.
Діалізом користуються в біохімічних дослідженнях для очищення високомолекулярних сполук (білків, нуклеїнових кислот, полісахаридів та інших) від низькомолекулярних і при отриманні лікарських засобів, у тому числі і білкових. Метод діалізу використовується в практичній медицині для очищення крові від природних низькомолекулярних «шлаків» і токсичних сполук при захворюванні нирок і деяких отруєннях (апарат «штучна нирка»).
Денатурація білків. Білки під впливом фізичних (температури, ультразвуку, йонізуючої радіації та інших), хімічних (мінеральних і органічних кислот, лугів, органічних розчинників, важких металів, алкалоїдів тощо) та біологічних факторів зазнають глибоких змін, пов'язаних з порушенням четвертинної, третинної і вторинної структури, що призводить до зміни фізико-хімічних і біологічних властивостей білка, тобто до денатурації (втрати нативності). При денатурації білка відбувається розрив «цементуючих» білкову молекулу вторинних зв'язків (водневих, дисульфідних, електростатичних, ефірних, вандервальсових та ін.). Це призводить до зміни просторової структури і зменшує його гідрофільні властивості. Білок стає більш гідрофобним, втрачає здатність розчинятись у звичайних для нього розчинниках і втрачає свої біологічні функції. Глибока денатурація є незворотною на відміну від взаємно-зворотної, при якій зміни структури білка бувають неглибокими і білок за деяких умов може знову набувати своїх нативних властивостей. Наприклад, при осадженні білків органічними розчинниками — спиртом або ацетоном (при низькій температурі), з подальшим видаленням осаджувача.
Процес денатурації білків широко використовується для осадження білка в біологічному матеріалі з метою подальшого визначення в ньому небілкових і низькомолекулярних сполук, для виявлення присутності білка і його кількісного визначення; для знезараження шкіри, слизових покривів і відходів в санітарній практиці; для зв'язування солей важких металів білком при лікуванні отруєнь солями меркурію, плюмбуму, купруму та іншими, або їх профілактики на виробництві. Після отруєння негайно приймають білки молока або збитих яєць, доки ці солі знаходяться в шлунку і не всмокталися. Після приймання білка у потерпілого викликають блювання, щоб видалити отруту з організму. Процеси денатурації білків спостерігають також при прийманні таніну чаю і танальбіну, що зумовлює їх в'яжучу і протизапальну дію. В'яжучі властивості таніну пов'язані з його здатністю осаджувати білки з утворенням густих альбумінатів, які захищають від подразнення чутливі нервові закінчення. При цьому зменшується безпосереднє потовщення клітинних мембран, що призводить до зменшення запальної реакції та послаблення болісних відчуттів. Препарат танальбін — продукт взаємодії таніну з білком казеїном, на відміну від таніну, не викликає в'яжучої дії на слизові оболонки рота і шлунка. При надходженні до кишечника, розщеплюється з виділенням вільного таніну. Використовується як в'яжучий засіб при гострих і хронічних захворюваннях кишечнику, особливо у дітей. У фармацевтичній практиці знайомство з процесом денатурації білка дозволяє контролювати якість білкових препаратів, наприклад в ампулах.
Кислотний гідроліз простого білка. Гідроліз пептидних зв’язків (міцний ковалентний зв'язок) йде достатньо важко. У живих організмах він відбувається групою ферментів – гідролаз, які називаються пептидазами (пептидгідролазами). Розрізняють ендопептидази (здійснюють гідроліз пептидних зв’язків, що знаходяться у середині молекули білка), екзопептидази (здійснює відщеплення кінцевих амінокислотних залишків або руйнування пептидних зв’язків, що знаходяться недалеко від кінця молекули).
Хімічний гідроліз білка можна здійснити, дією на розчин білка концентрованими кислотами при високій температурі протягом тривалого часу.
3.2 Експерементальна частина
3.2.1 Розчинність білків
В одну пробірку вносять 1 мл нерозведеного яєчного білка, 10 мл води, вміст перемішують. При цьому яєчний альбумін розчиняється, а яєчний глобулін випадає у вигляді невеликого осаду. У другу пробірку вносять 1 мл яєчного білка і 10 мл 5%-вого розчину натрію хлориду. У слабкому розчині солі розчиняються і глобуліни, і альбуміни. У дві інші пробірки поміщають невеликі кількості кератину (волосся). В одну вносять 10 мл, у другу — 10 мл 5%-вого розчину натрію хлориду. Указані білки не розчиняються ні у воді, ні в розчині солі.
3.2.2 Визначення ізоелектричної точки білків.
3.2.2.1 Визначення ізоелектричної точки казеїну.
У шістьох пронумерованих пробірках готують буферні суміші з різним значенням рН. Вміст пробірок збовтують і в кожну додають по 0,5 мл 0,1%-вого розчину казеїну. Після цього суміш у пробірках знову збовтують і відзначають величину помутніння розчину (див. нижче). Потім у кожну пробірку додають по 2 мл 95%-вого етилового спирту, збовтують і оцінюють ступінь мутності знаками «плюс» або «мінус»: відсутність осаду (-), наявність його (+), значне помутніння — декількома плюсами (не більше чотирьох). Ізоелектричну точку казеїну визначають за максимальним ступенем помутніння. У висновках слід визначити ІЕТ казеїну і можливість її практичного використання для виділення цього білка із молока (табл.1 ).
Таблиця 1. Хід визначення ІЕТ казеїну

пробірки Склад буферної суміші Ступінь мутності
0,2 моль/л СН3СООН 0,2 моль/л СН3СООNа рН суміші до додавання спирту після додавання спирту
1 1,9 0,1 3,4 2 1,8 0,2 3,8 3 1,4 0,6 4,4 4 1,0 1,0 4,7 5 0,6 1,4 5,1 6 0,2 1,8 5,7 3.2.2.2 Визначення ізоелектричної точки желатину.
Хід роботи.
У 6 пробірок відповідно до таблиці 2 відміряють відповідний об‘єм в мл розчинів оцтової кислоти, натрію ацетату, дистильованої води і желатину. Вміст кожної пробірки перемішують. Та в кожну повільно по стінкам доливають по 2 мл спирту 96%-вого (або ацетону 95%-вого). Через 30 хвилин визначають ізоелектричну точку. Вона буде відповідати рН пробірки із максимальним ступенем помутніння.
Таблиця 2. Співвідношення компонентів реакційної суміші (мл) для визначення рН при визначенні ізоелектричної точки желатину
Вода 0,1 моль/л СН3СООН 1 моль/л СН3СООН 0,1 моль/л СН3СООNa 1%-вий розчин желатина рН середовища
3,8 0,8 - 2,0 2,0 5,6
3,5 0,5 - 2,0 2,0 5,3
3,0 1,0 - 2,0 2,0 5,0
2,0 2,0 - 2,0 2,0 4,7
- 4,0 - 2,0 2,0 4,4
3,2 - 0,8 2,0 2,0 4,1
3.2.3 Висолювання білків сироватки крові
3.2.3.1 Висолювання білків сульфатом амонію.
А. У пробірку вносять 20 крапель сироватки крові і додають рівний об'єм насиченого розчину амонію сульфату (утворюється насичений розчин). При цьому випадає осад сироваткових глобулінів. Через 5—10 хв осад фільтрують і до фільтрату додають тонко подрібнений порошок амонію сульфату, доки він перестане розчинятися (повне насичення). Випадає осад альбумінів, його відфільтровують, а у фільтраті перевіряють повноту осадження білків, проводячи біуретову реакцію (див. роботу 1) та роблять висновок.
Б. В центрифужну пробірку вносять 3 мл 10 % яєчного білка, 3 мл насиченого розчину сульфату амонію та перемішують. Через 5 хв суміш центрифугують протягом 3–5 хв за 3000 g. Центрифугат, що містить альбуміни, зливають у пробірку, а осад, до складу якого входять глобуліни, розчиняють у 2 мл води. Цей розчин використовують для визначення глобулінів за допомогою біуретової реакції (розд. 5.1.3, реакція 1).
До центрифугату додають, помішуючи, кристалічний сульфат амонію до повного насичення розчину, тобто до появи на дні пробірки кристалів сульфату амонію. За цих умов у осад випадають альбуміни. Осад альбумінів відокремлюють центрифугуванням (З—5 хв за 3000 g). Вміст білка в фільтраті визначають за допомогою біуретової реакції. Негативна біуретова реакція свідчить про відсутність білка, тобто про повне осадження білків із розчину.
Таблиця 3. Вплив амонію сульфату на осадження білка.
Реактив, що застосовують для висолювання Ступень насичення розчину амонію сульфатом Фракція білків, що осаджується
3.2.3.1 Висолювання білків натрію хлоридом.
У пробірку вносять 3 мл 10 % розчину яєчного білка і насичений розчин натрію хлорид до повного насичення, через декілька хвилин в осад випадають глобуліни. Суміш фільтрують через складчастий паперовий фільтр. До фільтрату додають 1 мл концентрованої оцтової кислоти, суміш нагрівають на водяній бані до кипіння, альбуміни випадають в осад. Результати заносять у таблицю і роблять висновок.
Таблиця 4. Вплив хлориду натрію на осадження білка.
Реактив, що застосовують для висолювання Ступень насичення розчину хлоридом натрію Фракція білків, що осаджується
3.2.4 Діаліз білків.
Беруть невеликий квадратний аркуш целофану, замочують його в дистильованій воді і роблять з нього мішечок, закріплюючи між 2 скляними паличками за допомогою надітих на них ґумових кілець:

Піпеткою в мішечок обережно вносять 5мл 1%-вого розчину яєчного білка і 1мл 10%-вого розчину амонію сульфату. Мішечок занурюють у склянку з дистильованою водою, поклавши палички на край склянки. Рівень рідини в мішечку не має бути вище від рівня рідини в склянці. Через годину після початку діалізу беруть дві проби (по 10 крапель) зовнішньої рідини (діалізат) і проводять з однією із них біуретову реакцію (див. роботу 1) на білок, а з другою — реакцію на сульфати, додаючи 2—3 краплі 5%-вого розчину барію хлориду. Потім проводять ці ж проби з рідиною, що знаходилась у середині мішечка. Роблять висновок, де описують які компоненти знаходяться в середині рідини мішечка і в діалізаті (зовнішня рідина) і пояснюють, з чим це пов'язано.

3.2.5 Денатурація білка
3.2.5.1 Денатурація білка органічними розчинниками.
Органічні розчинники (спирт, ацетон та інші) зневоднюють колоїдні частинки білка, порушують гідрофобні взаємодії всередині білкової молекули і викликають її денатурацію, що призводить до зниження розчинності і осадження денатурованого білка. Короткочасна дія органічних розчинників при низькій температурі від 0 до 10°С зберігає білок в нативному стані.
У дві пронумеровані пробірки вносять 1 мл 1%-вого розчину яєчного білка і додають рівні об'єми органічних розчинників: у першу — 95%-вий етиловий спирт, у другу — ацетон. Перемішують вміст пробірок, спостерігають помутніння розчинів. Якщо до них додати по 1 мл насиченого розчину натрію хлориду, через деякий час білок випадає в осад.
3.2.5.2 Денатурація білка органічними кислотами.
Органічні кислоти здатні нейтралізувати заряд білка і руйнувати його просторову структуру, що призводить до денатурації і осадження білка. Реакції осадження білка трихлороцтовою (ТХО) та сульфосаліциловою кислотами знайшли широке практичне використання. Так, ТХО застосовують у кількісних аналізах для одержання безбілкових фільтратів, сульфосаліцилова кислота використовується в клінічних лабораторіях для виявлення білка в сечі, ексудатах та інших біологічних рідинах (чутливість 0,0015%).
У дві пробірки вносять 1 мл 1%-вого розчину яєчного білка і додають в одну з них 2 краплі 10%-вого розчину ТХО, а в другу - 2 краплі 10%-вого розчину сульфосаліцилової кислоти. В обох випадках спостерігається випадіння осаду білка.
3.2.5.3 Денатурація білка концентрованими мінеральними кислотами.
Кислоти, крім ортофосфорної, викликають дегідратацію білкових часток і їх нейтралізацію. Порушення просторової структури білка призводить до утворення осаду, у вигляді комплексних солей білка з кислотами.
У три пробірки вносять по 1 мл нітратної, хлоридної та сульфатної концентрованих кислот і обережно, тримаючи пробірку під кутом 45°, нашаровують на кислоту 0,5 мл 1%-вого яєчного білка. На межі розподілу двох рідин з'являється осад у вигляді білкового кільця. Обережно струшують кожну з пробірок та роблять висновок, зазначаючи ефект реакції.
Реакцію осадження білків нітратною кислотою використовують у клінічних дослідженнях сечі (проба Геллера). Ця якісна реакція лежить в основі кількісного і якісного визначення білка в сечі по методу Робертса-Стольникова-Брандберга.
3.2.5.4 Денатурація білка «алкалоїдними» реактивами.
При додаванні до розчину білка так званих «алкалоїдних» реактивів (таніну, пікринової кислоти, фосфатно-вольфраматної, фосфатно-молібдатної кислоти та інш.) білок випадає в осад. Реакція обумовлена наявністю у білку нітрогеновмісних гетероциклічних угруповань, аналогічних тим, які зустрічаються в алкалоїдів (індольні, імідазольні, пірольні та інші кільця). При цьому «алкалоїдні» реактиви являють собою аніони, а білки — катіони. Слабке підкиснення білкового розчину оцтовою кислотою приводить до появи позитивного заряду на частинці білка і полегшує взаємодію білка з негативно зарядженими йонами осаджувача. Білки, що мають лужний характер (протаміни, гістони), добре осаджуються алкалоїдними реактивами в нейтральному середовищі без підкиснення.
У три пробірки вносять по 1 мл 1%-вого розчину яєчного білка. У першу додають 2—3 краплі 10%-вого розчину пікринової кислоти і 0,5 мл 1%-вої оцтової кислоти. У другу пробірку додають 1—2 краплі насиченого розчину таніну і 0,5 мл 1%-вої оцтової кислоти. У третю 2-3 краплі 1%-вого розчину калію гексаціано-(ІІ)-феррату і 0,5 мл 1%-вої оцтової кислоти. Спостерігають за випаданням осадів денатурованого білка і дають пояснення. Додають надлишок реагентів, після додавання надлишку розчину калію гексаціано-(ІІ)-феррату та розчину таніну осад розчиняється. Результати заносять у таблицю і роблять висновок.
Таблиця 5. Вплив алкалоїдних реактивів на осадження білка.
«Алкалоїдні» реактиви Ефект при додаванні білку Надлишок реактиву
Суміш пікринової і оцтової кислот Суміш таніну і оцтової кислоти Суміш калію гексаціано-(ІІ)-феррату і оцтової кислоти 3.2.5.5 Денатурація білка важкими металами.
Білки при взаємодії з солями важких металів (купруму, плюмбуму, меркурію, цинку, аргентуму та інш.) утворюють нерозчинні у воді комплексні сполуки. Ці йони зв'язуються з функціональними групами білкових радикалів амінокислот у молекулі білка, у результаті чого руйнується його просторова структура і відбувається осадження денатурованого білка. При додаванні залишку солей важких металів, крім аргентуму нітрату і меркурію (II) хлориду, відзначають розчинення первісно утвореного осаду через адсорбцію йонів металу на поверхні денатурованого білка і виникнення позитивного заряду на частинках білка (адсорбційна пептизація). При цьому білок у розчині залишається денатурованим.
У три пробірки вносять по 1 мл 1 %-вого розчину яєчного білка. У першу додають 1-2 краплі 5%-вого розчину купруму сульфату, у другу – 1-2 краплі 1%-вого розчину аргентуму нітрату, а в третю – 1-2 краплі 1%-вого розчину плюмбуму ацетату. Спостерігають за появою осаду. Потім додають у кожну з пробірок надлишок відповідного осаджувача і спостерігають за змінами в осаді.Внаслідок додавання надлишку купрум (ІІ) сульфату та плюмбум ацетату осад, що утворивс, розчиняється.
Результати заносять у таблицю і роблять висновок.
Таблиця 6. Вплив йонів важких металів на осадження білка.
Реактив осаджувач Ефект при додаванні білку Надлишок реактиву
CuSO4 (CH3COO)2Pb 3.2.5.5 Денатурація білка при кип'ятінні.
При кип'ятінні нейтральних та слабокислих розчинів білка останній денатурує та випадає в осад.
У 5 пронумерованих пробірок вносять по 1 мл 1%-вого розчину яєчного білка. Першу пробірку нагрівають до кипіння, відзначають помутніння розчину (відбувається руйнування гідратної оболонки навколо молекули білка та та збільшення білкових частинок, але міцели – частинки денатурованого білка несуть заряд і утримуються в завислому стані). Другу пробірку нагрівають до кипіння і додають 1 краплю 1%-вого розчину оцтової кислоти, для створення слабко кислої реакції. При стоянні випадає осад білка (частинки білка втрачають заряд, томущо рН середовища близька до ізоелектричного стану). У третю пробірку додають 1 краплю 10%-вого розчину оцтової кислоти, для створення кислої реакції середовища. При кип'ятінні рідини осад не утворюється. В дуже кислому середовищі частинки білка набувають позитивного заряду, тобто перезаряджаються і відштовхуються одна від одної. У четверту пробірку додають 1 краплю 10%-вого розчину оцтової кислоти і 1 краплю насиченого розчину натрію хлориду. При кип'ятінні випадає осад — йони Nа+ та С1- утворюють подвійний електричний шар і нейтралізують позитивний заряд на частинках білка. У п'яту пробірку додають 1 краплю 10%-вого розчину натрію гідроксиду. При кип'ятінні зсідання білка не спостерігається, оскільки в лужному середовищі негативний заряд на частинках білка підвищується.
Результати осадження білків при кип'ятінні в різноманітних середовищах заносять у таблицю.
Таблиця 7. Вплив реакції середовища на осадження білка при кип'ятінні.
Нейтральне середовище Слабкокисле середовище Сильно кисле середовище Сильно кисле середовище у присутності електроліту Лужне середовище
3.2.6 Проведення гідролізу білка.
У термостійку колбу на 100-150 мл наливають 20 мл розчину білка і 5 мл концентрованої хлоридної кислоти. Колбу із зворотним холодильником кип’ятять на плитці протягом 45 хвилин (з моменту закипання) під тягою.
Відкриття проміжних продуктів розпаду білка.
Біуретова реакція з вихідним розчином білка.
До 0,5 мл розчину білка додають 1 мл 30%-вий розчин NaOH і 1 мл 5%-вий розчин CuSO4.
Біуретова реакція гідролізату через 15, 30, 45 хвилин
Відберіть пробу гідролізу через 15 хвилин. До 0,5 мл гідролізату додайте 1 мл 30%-вого розчину NaOH і 1 мл 5%-вого розчину CuSO4. Теж саме виконайте з пробою через 30 і 45 хвилин. Дані занесіть до таблиці 8.
Таблиця 8. Результати гідролізу білка.
Час гідролізу, хвилин 0 15 30 45
Забарвлення Продукти реакції Визначення карбоксильних і аміногруп у розчині білка та гідролізаті.
Через 45 хвилин гідроліз припиняють. Холодильник відкладають, а у колбу додають (на кінчику шпателя) активоване вугілля для знебарвлення бурого розчину і кип’ятять 5 хвилин. Потім гідролізат охолоджують, переливають у мірний циліндр, і об’єм доводять до 25 мл дистильованою водою і фільтрують.
Титрування карбоксильних груп.
Суть методу полягає у блокуванні аміногруп формальдегідом, а вільні карбоксильні групи відтитровують лугом.
Титрування карбоксильних груп у розчині білка.
Відміряють у конічну колбу 1 мл розчину білка, додають 5 крапель 20%-вого нейтрального розчину фенолфталеїну. Титрують до стійкого рожевого кольору 0,005 н розчином NaOH. Кількість витраченого NaOH на титрування заносять до таблиці.
Титрування карбоксильних груп у гідролізаті білка.
Для титрування відбирають 1,25 мл гідролізату (знебарвленого), що відповідає 1 мл розчину білка, додають 3 краплини розчину фенолфталеїну і нейтралізують 10%-вим розчином NaOH до рожевого забарвлення (кількість лугу не враховують). Якщо забарвлення стане яскраво червоне, використовують 1%-вий розчин хлоридної кислоти і 0,005 н NaOH для одержання слабко рожевого забарвлення. Після чого додають 5 крапель нейтрального розчину формаліну і титрують 0,005 н NaOH до стійкого рожевого забарвлення. Кількість NaOH, витраченого на титрування, заносять у таблицю 9.
Таблиця 9. Хід титрування.
Розчини Кількість NaOHКількість вільних карбоксильних груп
Розчин білка Гідролізат білка 3.4 Питання для самоконтролю
(домашнє завдання).
Чим обумовлений заряд білків у водному розчині? Назвіть білки основного та кислотного характеру.
Що таке ІЕТ білка?
Чому в ізоелектричній точці білки випадають в осад?
Які основні фактори забезпечують стабільність молекул білка в розчині?
Що таке денатурація білків?
Що таке висолювання білків?
Чим відрізняється денатурація від висолювання?
Фактори, що викликають денатурацію білків?
Властивості денатурованих білків.
Що таке діаліз?
Як довести, що при діалізі білок залишається в целофановому мішечку, а йони солі знаходяться в діалізуючій рідині?
Якими методами можна вивільнити розчин білку від низькомолекулярних речовин?
Дано 3 пробірки з розчинами різних білків:
А) розчин альбуміну
Б) суміш альбуміну і глобуліну
С) розчин глобуліну.
Використовуючи метод висолювання амонію сульфатом, визначити, які білки містяться в кожній пробірці.
Значення реакції осадження білків у харчовій промисловості.
Чи відбувається гідроліз білків у живій клітині? Відповідь обгрунтуйте.
Які умови хімічного гідролізу білка?
Чому застосовують переважно кислотний, а не лужний гідроліз білка?
Як можна впевнитися, що гідроліз відбувся?
Лабораторна робота № 4
Дослідження білків молока
4.1 Мета: провести осадження білків молока та кількісне визначення казеїну формольним титруванням.
4.2 Короткі теоретичні відомості
Молоко - полідисперсна система. Молоко і продукти його переробки є цінною сировиною і напівфабрикатами. Їхня висока біологічна цінність обумовлена оптимальним вмістом і майже ідеальним співвідношенням білків, ліпідів, вуглеводів, мінеральних солей і вітамінів. Завдяки складу і збалансованості амінокислот ці речовини засвоюються організмом людини майже повністю.
Ступінь чистої утилізації молочного білка в організмі людини становить 75%).Білки коров'ячого молока багаті на лізин і треонін, лімітуючими амінокислотами є метіонін і цистеїн.
Завдяки колоїдному стану білки молока легкодоступні для дії травних ферментів. Харчова цінність білків збільшується завдяки тому, що вони утворюють комплекси з вітамінами, особливо групи В, і мінеральними речовинами.
Харчова цінність молока і вихід таких молочних продуктів, як кисломолочний сир, сири сичужні залежить від вмісту білка. Білки молока є найціннішими в харчовому відношенні. Вміст білків у молоці коливається в межах 2,8-4,0%.
Молоко містить більше ніж 20 білків. їх поділяють на дві групи: казеїни (складні білки) і сироваткові (прості білки). Вони відрізняються один від одного за молекулярною масою, ізоелектричною точкою, співвідношенням амінокислот, особливостями складу і структури.
Вміст казеїну в молоці становить 73-85% усіх білків. Казеїн має вигляд колоїдних частин або міцел (ниток), що складаються з більш дрібних частин (субміцел). Казеїн чутливий до дії іонів кальцію. За їх наявності випадає в осад. Казеїн є фосфопротеїном, оскільки містить у своєму складі фосфорну кислоту. Він приєднує до себе кальцій, магній, натрій, мінеральні речовини. У складі казеїну є чотири фракції, що відрізнявзться за вмістом амінокислот, фосфорної кислоти, за чутливістю до дії іонів кальцію та сичугового ферменту. Казеїн у молоці міститься у вигляді кальцій-фосфат-казеїновому комплексу. Він складається з казеїнату кальцію, колоїдного фосфату кальцію, лимонної кислоти, магнію, калію і натрію.
Після осадження казеїну в ізозлектричяій точці виявляються сироваткові білки. До їх складу входять -лактаглобулін, α -лактоальбумін, альбумін сироватки крові, імуноглобуліни і протеозопептидна фракція.
Здатність казеїну легко коагулювати під дією кислоти, сичужного ферменту (пепсину) та наростання іонів кальцію широко використовується у виробництві кисломолочних продуктів, сичужних сирів та бринзи. Іншу значну частину білків складають сироваткові білки (15-20% всіх білків). Відділяють сироваткові білки внаслідок кип'ятіння прозорих фільтратів, отриманих після осадження казеїну. Дані білки містять багато незамінних амінокислот (метіоніну, цистеїну, треоніну), що має важливе значення при їх використанні в подальшому для харчових цілей. У багатьох країнах світу вже давно введені розцінки за молоко з врахуванням вмісту білка. Найближчим часом це планується робити і в Україні.
У нейтральному середовищі білки молока не коагулюють при кип'ятінні, хоча й денатурують. Осадження казеїнів відбувається під впливом молочної кислоти, що утворюється під дією мікроорганізмів у процесі скисання молока. При коагуляції білків молока кальцій хлоридом в осад переходять усі їх фракції. *Такий метод використовують тоді, коли готують прісний сир з молока для дітей на молочних кухнях, а також білок молочний харчовий з пахти (відходи, що залишаються при виготовленні масла). Ці продукти в 4–5 разів багатші на Кальцій та Фосфор, ніж кисломолочний сир.
Ацетон у нерозчиненому вигляді, спричиняючи дегідратацію білків, осаджує їх із розчину. Наполовину розбавлений ацетон не викликає коагуляції білків молока. У разі накопичення в молоці кислот стійкість білків знижується, і додавання 50% розчину ацетону викликає їх коагуляцію. Це відбувається при такій кількості кислот у молоці, яка ще не відчувається на смак. Проба з ацетоном використовується для визначення свіжості молока, що особливо важливо для підприємств харчування, які обслуговують дітей, а також для дієтичних їдалень.
4.3 Експерементальна частина
Прилади та реактиви: нагрівальний прилад; штатив із пробірками; крапельниці; мірні циліндри на 10 мл; папір індикаторний універсальний; колби на 50 мл; конічні колби на 100 мл; бюретки на 25-50 мл; лійки; молоко; кальцій хлорид, розчин; ацетон, 50% розчин; буфер; H2S04 розчин 1:3; крохмальний розчин КІ (3 г КІ та 3 г крохмалю у 100 мл води); сульфатна кислота (р = 1,82 г/см3); нітратна кислота (р = 1,30 г/см3); калій йодид, 5% розчин; розчин крохмалю, 2% розчин; хлоридна кислота, концентрована; фенолфталеїн, 1% розчин; натрій гідроксид, 0,1 нроз-чин; формалін, 40% розчин.
4.3.1. Осадження казеїну. У пробірку наливають близько 2 мл молока і доводять його до кипіння, потім додають 5-6 крапель 10% розчину кальцій хлориду, спостерігають появу осаду.
4.3.2. Осадження білків молока ацетоном (використовується для вивчення свіжості молока). У дві пробірки наливають по 1 мл молока. В одну з них додають таку саму кількість лимоннокислого буфера, , рН якого дорівнює 5,0 (замішують 10,3 мл 0,2 М розчину NaH2P04 ■ 2Н20 із 9,7 мл 0,1 М розчину лимонної кислоти С6Н807), доводячи рН суміші до 5,0 (контролюють за допомогою індикаторного папірця). Струшуючи цю пробірку, переконуються у відсутності на стінках коагулянту (крихти на стінках пробірки). Потім в обидві пробірки доливають по 1 мл 50% розчину ацетону, енергійно струшують, спостерігають появу згустків на стінках пробірки.
4.3.3 Визначення наявності гідроген пероксиду. У пробірку наливають 2 мл молока, не перемішують; додають 1 мл розчину сульфатної кислоти (розчин 1:3) та 0,2 мл крохмального розчину (3 г КІ та 3 г крохмалю у 100 мл води). Через 10 хвилин спостерігають за зміною забарвлення розчину в пробірці, не струшуючи її. Поява в пробірці окремих плям синього кольору свідчить про наявність гідроген пероксиду в молоці.
4.3.4. Реакція на наявність формальдегіду в молоці. До
1 мл розчину (100 мл H2S04(р = 1,82 г/см3) і одна крапля HN03(р = 1,30 г/см3)) обережно по стінці доливають таку саму кількість молока. При додаванні молока пробірку слід нахилити так, щоб рідина не змішувалася, а один шар накладався на інший. За наявності формальдегіду через одну - дві хвилини з'являється фіолетове або темно-синє кільце.
4.3.5. Реакція на наявність хлору в молоці. До 10 мл молока додають у колбу 1 мл 5% розчину КІ і 1 мл свіжоприготова-ного 2% розчину крохмалю, перемішують, доливають в 10 мл концентрованої хлоридної кислоти і перемішують. Якщо в молоці наявний хлор, через 5—10 хвилин у колбі з'являється синє забарвлення рідини.
4.3.6. Визначення казеїну формольним титруванням. У конічну колбу відмірюють циліндром 10 мл молока, додають 5 крапель розчину фенолфталеїну і з бюретки обережно титрують 0,1 н розчином натрій гідроксиду, увесь час перемішуючи рідину до появи не-зникаючого протягом хвилини слаборожевого забарвлення. Потім у рідину додають 2 мл попередньо нейтралізованого розчину формаліну і, коли рідина почне знебарвлюватися, знову продовжують обережно титрувати з тієї самої бюретки до появи слабкорожевого забарвлення, яке не зникає протягом однієї хвилини. Рівень лугу в бюретці записують і за різницею з першим титруванням визначають кількість лугу, який пішов на друге титрування. Отриману цифру помножують на 1,47 і знаходять вміст казеїну в молоці у відсотках, а після множення на 1,94 визначають загальну кількість білка в молоці.

3.4 Питання для самоконтролю
(домашнє завдання).
1. Які білки входять до складу молока ?2. Яка ізоелектрична точка казеїну ?3. Які є методики осадження білків молока ?
4. На якому принципі базується методика кількісного визначення білків молока?

Приложенные файлы

  • docx 23905805
    Размер файла: 159 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий