Микробиологические среды

ВВЕДЕНИЕ
УДК 619:576.8 ББК48.4 Р 13
Печатается по постановлению Редакционно-издательского совета АНТ
Рецензенты: зав. кафедрой микробиологии Казанского государственного университета, докт. биол. наук, профессор, дейст-вит. член АН Республики Татарстан И. Б. Лещинская; зав. кафедрой микробиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины, докт. ветер, наук, профессор Р. Г. Госманов.
Равилов А. 3., Гильмутдинов Р. Я., Хусаинов М. Ш.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ. Казань: Фэн, 1999.-398 с.
В книге проанализированы микробиологические среды и использование их в различных областях биологии, медицины и ветеринарии как в нашей стране, так и за рубежом. Особое внимание уделено наиболее часто используемым компонентам микробиологических сред, информация о которых относительно слабо освещена в современной литературе. Приводятся сведения о современных средах, анализируются их достоинства и недостатки, рассматривается история изучения вопроса. Максимально полно исследован вопрос использования сред при работе с такими инфекционными агентами, как энтеробактерии, микобактерии, микоплазмы, стрепто- и стафилококки, грибы.
Книга рассчитана на практических врачей и научных сотрудников ветеринарного и медицинского профиля, работающих в области микробиологии, микологии и инфекционной патологии, а также специалистов гос.-сан. эпидемиологической службы, пищевой и микробиологической промышленности.
Конструирование и производство качественных стандартных питательных средодна из важнейших проблем биотехнологии, медицинской и ветеринарной микробиологии (Смирнова Г. А., 1991).
Несмотря на успехи, достигнутые в борьбе с инфекционными болезнями, уровни заболеваемости в мире остаются высокими: появляются новые болезни; отмечается возвращение старых, которые считались практически искорененными. В Латинской Америке участились случаи холеры, в Россиирезко увеличилось число заболевших дифтерией. Наблюдается распространение болезней Лайме, легионеров, синдрома токсического шока и других (Ecologist, 1995). В структуре причин смертей в Европе инфекционные болезни занимают 3-е место, уступая лишь сердечно-сосудистой патологии и онкологическим заболеваниям. В США при ранжировании причин смертей инфекционные болезни вышли на 4-е место. Успешная борьба с инфекциями возможна лишь при условии истинности диагноза и хорошо налаженного эпидемиологического надзора с использованием широкого спектра лабораторных методов. Система эпид. надзора предполагает обязательное применение данных микробиологических исследований (Покровский В. И. и соавт., 1995).
По информации ВОЗ ежегодно в мире острые кишечные инфекции (ОКИ) переносят 2 млрд. человек. Этиологическая структура ОКИ в разных странах существенно разнится. Так, в Великобритании 1-е место среди бактериальных ОКИ занимает кам-пилобактериоз, во многих странах Европысальмонеллезы, в Япониизаболевания, вызываемые парагемолитическим вибрионом. В России же из более чем 5 млн. случаев ОКИ, зарегистрированных за последние 10 лет, этиология половины (55,6%) не установлена. Из расшифрованных1-е место принадлежит ши-геллезам. Широко распространенный кампилобактериоз диагностируется плохо из-за отсутствия необходимого лабораторного оборудования и недостаточного знакомства медработников с методами выделения микроаэрофильных бактерий.
За последние 10 лет отмечена тенденция роста заболеваемости чумой в мире, с ежегодным темпом прироста на 12,5%, что связано с активацией эпидемиологического процесса в Африке. В Азии эта цифра составляет 18,5%. Последняя вспышка в Индии выявила неподготовленность органов здравоохранения. Эпидемиологическую ситуацию по России следует считать неустойчивой в связи с наличием возбудителя чумы в его резервуарах и опасностью завоза из-за границы (Мишанькин Б. Н. и соавт., 1995).
Поданным ВОЗ 1/3 населения мира заражена М. tuberculosis, a Schultze G. (1992) считает, что показатель инфицированности населения мира туберкулезом достигает 50%. Ежегодно регист-

ISBN 5-7544-0137-Х
© Издательство «Фэн». 1999
3
рируется 810 млн. случаев туберкулеза и 34 млн. человек умирают. Стало увеличиваться число случаев туберкулеза в европейских странах. В США с 1988 по 1993 годы туберкулез у детей возрос на 40%, преимущественно за счет городского контингента.
В системе Гос. сан.-эпид. надзора РФ потребителями микробиологических сред являются лаборатории бактериологические и особо опасных инфекций. 1-ые занимаются идентификацией возбудителей пищевых отравлений и воздушно-капельных инфекций, а 2-ыевозбудителей бруцеллеза, чумы, листериоза, ле-гионеллеза, туляремии, лептоспироза, туляремии, сибирской язвы, холеры и бореллиоза. Используются среды при исследовании фармацевтического сырья, антибиотиков, витаминов и косметических средств; питьевых, промышленных и сточных вод; молока и молочных продуктов; мяса и мясных продуктов, яиц, хлебобулочных изделий и напитков.
Потребителями сред для микобактерий является противотуберкулезная служба МЗ РФ, а среды для культивирования возбудителей сифилиса, гонореи и кожных заболеваний (грибы) применяются в учреждениях дермато-венерологического профиля.
Крупномасштабно используются питательные среды в микробиологической промышленности для культивирования патогенных микроорганизмов с целью изготовления вакцин, а также при культивировании микроорганизмовпродуцентов ценных биологически активных продуктов.
К сожалению, даже в относительно благополучные времена существования СССР ассортимент выпускаемых у нас питательных сред намного уступал таковому ведущих зарубежных стран: США, ФРГ, Великобритании (Смирнова Г. А., Муравьева В. А., 1984). В связи с напряженной эпидемиологической обстановкой в Российской Федерации (увеличение заболеваемости дифтерией, туберкулезом, сифилисом, природно-очаговыми и зооноз-ными инфекциями; высокий уровень заболеваемости коклюшем, дизентерией, брюшным тифом, сальмонеллезом, гонореей и внутрибольничными инфекциями), одной из основных задач Министерства здравоохранения является расширение ассортимента и совершенствование качества питательных сред (Они-шенко Г. Г., 1997).
После разрушения системы централизованного обеспечения микробиологическими средами образовавшуюся нишу достаточно активно и успешно заполнило большое количество фирм, представительств и предприятий, специализирующихся как на их производстве и реализации, так и на чисто посреднических функциях. При этом цены и качество реализуемой продукции зачастую значительно варьируют. Достаточно активно внедряются на наш рынок иностранные компании из США, Англии, Франции, Испании, Германии, Индии и других стран. Между тем, положение потребителей затрудняется отсутствием полной информации об этих организациях и их продукции.
Определенные трудности испытывают сотрудники научно-исследовательских учреждений и ВУЗов при изготовлении микробиологических сред в связи с дефицитом многих компонентов тех или иных рецептур, обилием самих рецептур и в целом, с отсутствием обобщающего современного анализа этих вопросов.
Учитывая изложенное, мы в представленной работе попытались обобщить литературу по микробиологическим средам, в основном за последние 1015 лет.
1. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ
О МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ
И ИХ КОМПОНЕНТАХ
1.1. Классификация сред, терминология
Большинство существующих классификаций сред достаточно условно и не всегда обосновано, что отмечается и самими авторами (Семенов С. М., 1990 и др.).
По составу микробиологические среды подразделяются на естественные (натуральные), искусственные (полусинтетические) и синтетические (Блинов Н. П. и соавт., 1988; Семенов С. М., 1990). Однако Федоров Р. В. (1990), характеризуя состав сред, использует термины «безбелковые», «белковые» и «минеральные», а деление на естественные и искусственные, на его взгляд, это классификация по происхождению.
По консистенции среды могут быть жидкими (бульоны), полужидкими (с добавлением 0,30,7% агара), полуплотными, плотными (1,52% агара), а также, по классификации Блинова Н. П. и соавт. (1988), сыпучими и сухими. Сыпучие среды используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. Это разваренное пшено и кварцевый песок, пропитанный питательным раствором. Сухие среды представляют собой гигроскопические порошки или гранулы с влажностью до 10%. Гранулированная форма имеет ряд преимуществ по сравнению с порошкообразной: при работе с ней образуется меньше мелкодисперсной пыли, которая может вызвать аллергические реакции; кроме того, гранулы не прилипают к стенкам сосудов, облегчая, тем самым, взятие навесок; быстро пропитываются водой и образуют растворы, не содержащие комочков (Подунова Л. Г. и соавт., 1996). Часто используются в качестве синонимов термины «твердые», «полутвердые», «мягкие». В некоторых случаях для уплотнения сред применяется желатин (1015%) и силикагель. Ряд естественных питательных сред (свернутые сыворотка крови, яичный белок) сами по себе являются плотными (Борисов Л. Б. и соавт., 1993).

4
5
По целевому назначению среды делятся на основные (питательные основы), элективные и дифференциально-диагностические (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). Лабинская А. С. (1978) подразделяет среды по этому принципу на общего назначения и специальные, относя к последним элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические. Под средами общего назначения фактически рассматриваются питательные основы: мя-со-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ) и др. В то же время Федоров Р. В. (1990), опираясь на данный критерий, выделяет среды обычные или простые, специальные или элективные и дифференциально-диагностические. Таким образом, дифференциально-диагностические среды по непонятным, во всяком случае для нас, соображениям выделяются им из специальных сред в самостоятельную группу. Семенов С. М. (1990) по назначению среды разделяет на дифференциально-диагностические, элективные, накопительные (обогащения, накопления), ингибиторные, селективные, индикаторные и консервирующие (транспортные).
Виестур У. Э. и соавт. (1980) классифицируют питательные среды по назначению на диагностические и производственные. Первые предназначены в основном для обнаружения, выделения и идентификации патогенных микроорганизмов по морфологическим и биохимическим признакам и, в свою очередь, делятся на элективные, обогатительные, консервирующие и дифференциально-диагностические. Производственные среды подразделяются по составу на посевные и основные ферментационные, приготовленные в большинстве случаев на полупродуктах и отходах сельскохозяйственного и пищевого производства с добавками минеральных солей.
Требования к производственным средам: максимальный выход продукции (в частности, токсинов и др.) и бактериальной массы, дешевизна. Проблемой является загрязнение бактериальной массы компонентами культуральной среды, в частности белками сыворотки крови, вынуждающее использовать многократное отмывание и концентрирование.
На наш взгляд, по целевому назначению среды можно было бы классифицировать как культуральные, дифференциально-диагностические, производственные и специальные.
Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С. (1981), Блинов Н. П. и соавт. (1988) подразделяют среды на 4 группы: универсальные (обычные или простые, по терминологии Блинова Н. П. и соавт., 1988) специальные, избирательные (элективные) и дифференциально-диагностические. При этом «универсальные» (по терминологии Пяткина К. Д., Кривошеина Ю. С., 1981) и «основные» (по терминологии Борисова Л. Б. и соавт., 1993) среды фактически представляют собой одну и ту же группу.
В «Руководстве по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней (М., 1962) диагностические среды
б
делятся на консервирующие, обогащения, элективные и дифференциально-диагностические.
В более позднем «Руководстве по микробиологической диагностике инфекционных болезней» (М., 1973) среды делятся на 3 группы: 1. для культивирования, включающие универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования; 2. для выделения и накопления, включающие среды консервирующие, накопления и элективные; 3. для идентификации, включающие дифференциальные и элективно-дифференциальные.
Дифференциально-диагностические средыпредназначены для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип их построения основан на видовом различии в биохимической активности бактерий вследствие неодинакового набора ферментов (Борисов Л. Б. и соавт., 1993), а также по культуральным свойствам (Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981). В состав этих сред входят: питательная основа, обеспечивающая размножение бактерий; определенный углевод, различное отношение к которому является диагностическим признаком данного вида бактерии; цветной индикатор рН (например, индикатор Андреде), свидетельствующий о сдвиге рН в кислую сторону вследствие ферментации соответствующего углевода (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). К ним относят среды для определения протеолитической, гемолитической и восстановительной (редуцирующей) способностей микробов, ферментации углеводов, а также среды, содержащие вещества ассимилируемые только определенными микробами.
К группе дифференциально-диагностических относят и селективные среды, предназначенные для дифференциации про-то- и ауксотрофных бактерий (Пяткин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981).
Рекомендуется 5 критериев для оценки селективных сред Mossel D. (1986). Продуктивностьсоотношение между количеством колоний выделяемого вида бактерий, выросших на селективной среде с и без селективных агентов. Селективность соотношение между количеством колоний ингибируемых видов бактерий выросших на селективной среде с и без селективных агентов. Дифференциабельность (элективность) способность легко различать на селективной среде колонии разных видов бактерий. Действенностьвыделение при использовании данной селективной среды из образцов искомых видов бактерий и ингибирование сопутствующих. Систематическая необъективностьпределы, в которых использование данной селективной среды ограничивает выделение из образцов того или иного вида бактерий или биотипа искомой группы, или вида бактерий.
В универсальном варианте селективная среда должна удовлетворять следующим требованиям: обеспечивать рост 100% штаммов конкретного вида микроорганизма, даже при наличии еди-
7
ничных клеток в пробе; полностью подавлять рост любых видов сопутствующей микрофлоры; не изменять видовые свойства исследуемого микроорганизма; быть простой в изготовлении и не содержать дефицитных или дорогостоящих компонентов (Рожа-вин М. А., Бугаева Е. И., 1986).
Элективными называются среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида или группы из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологических особенностей конкретных микроорганизмов, отличающих их от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации NaCl, холерного вибрионав щелочной среде и т. д. (Борисов Л. Б. и соавт., 1993). К ним относятся среды обогащения (накопления, enrichment), в которых интересующий исследователя вид растет интенсивнее и быстрее сопутствующей микрофлоры (Пят-кин К. Д., Кривошеий Ю. С, 1981). В свою очередь, Калина Г. П., Комзолова Н. Б. (1988) в обзоре, касающемся Ps. aeruginosa, подразделяют среды накопления на неселективные и инги-биторные.
Специальные средыпредназначены для выращивания бактерий, не размножающихся на «универсальных» («основных») средах. К ним относятся кровяной агар, сывороточные агар и бульон и др. Как специальные, очевидно, можно рассматривать и восстановительные среды, а также среды для определения антибиоти-кочувствительности микроорганизмов. К последним относятся агар АГВ (НПО «Питательные среды», Махачкала) и его зарубежные аналогиагары Мюллера-Хинтона и ИзоСенситест. К сожалению переход в ближайшем будущем микробиологических лабораторий нашей страны к использованию агара Мюллера-Хинтона, в соответствии с наиболее часто применяемыми в международной практике стандартами Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS) не представляется возможным (Козлов Р. С. и соавт., 1996).
Краткую инструкцию по классификации питательных сред, значению отдельных ингредиентов, входящих в них, их приготовлению и хранению предлагает Kreuzer К. (1994).
1.2. Питательные основы
Каждый ингредиент питательных сред оказывает то или иное влияние на микроорганизмы и изучение стимуляции и ингиби-рования их жизнедеятельности компонентами среды имеет важное значение, в том числе для разработки процессов культивирования при получении бактериальной массы с заданными свойствами и продуктов вторичного метаболизма (Мельникова В. А. и соавт., 1991).
К наиболее часто используемым компонентам микробиологических сред относятся питательные основы животного и растительного происхождения, агар-агар, красители, антибиотики, сыворотка крови, минеральные соли и твины.
При изготовлении питательной основы микробиологических сред предлагается масса источников белкавозможных заменителей мяса. В настоящее время мясные основы в большинстве случаев уступили место казеину и продуктам его переработки, которые применяются в составе питательных сред уже многие годы (Смирнова Г. А., 1991).
Еще в 1949 году Чанпалов П. Ф. рекомендовал использовать для этих целей отходы рыбной промышленности. Предлагаются кровяно-дрожжевые автолизаты (Васильева 3. И. и соавт., 1972; Стефанов А. В. и соавт., 1975; Тароков М. И. и соавт., 1980). Как источники белка рекомендуются куриные эмбрионы, обрат молока и казеин (Иванов М. М., Михайлов Н. А., 1977; Лопатнев С. В., Клейнер Г. И., 1979), а также растительное сырье, например водоросль хлорелла (Гесландзе К. Д., 1978; Че-ренкова Е. П., Ефимова Т. П., 1979), горох, сою, плоды тунгового дерева (Гизитдинов Н. Н., 1981) и даже навоз (Афанасов Э. Э. и соавт., 1977; Сведенцов Л. М. и соавт., 1978). Более современные источники по использованию немясных питательных основ животного и растительного происхождения представлены в обзоре Смирновой Г. А. (1991).
Обоснована возможность применения в качестве белковой основы питательных сред гидролизатов отходов переработки сыворотки крови животных (фибрина, отходов изготовления препаратов иммуноглобулинов и их смеси) (Шептун Н. Г, 1989) и кровяных сгустков (Голиков А. В. и соавт., 1987).
Мельник В. П., Медковская Р. Л. (1992) рекомендуют с целью упрощения процесса получения белковой основы сред и ее удешевления использовать обварочный бульон мясокомбинатов, полученный из субпродуктов второй категории, и подщелачивать его 2,58,5 г/л сульфатом алюминия.
Шиловская Т. Е., Литвинец Е. Н. (1992) предлагают готовить питательную основу микробиологических сред, добавляя к стабилизированной крови животных, используемой в качестве исходного сырья, смесь хлористоводородной и муравьиной кислот, нейтрализуя полученную смесь гидроокисью калия, и добавляя, в заключение, осветленную молочную сыворотку.
Сравнительное исследование, проведенное Смирновой О. А., Давыдовой Н. А. (1987), показало сопоставимость биологических свойств гидролизатов биомассы Е. coli и рыбного, широко применяемого в бактериологии. Ростовые свойства сред для диагностики кишечных инфекций, приготовленных на основе гид-ролизата Е. coli, были даже несколько выше таковых, приготовленных на рыбном гидролизате. Дешевизна и доступность исход-

8
9
ного сырья дают основание полагать, что гидролизат кишечной палочки можно использовать для частичной замены сред, получаемых из мясных и рыбных продуктов.
Сорокин В. Г. и соавт. (1996) разработали технологию промышленного получения дрожжевого экстракта, содержащего 4050% свободных аминокислот, витаминов (группы В, РР), ми-кро-и макроэлементов, биологически активных веществ (холин и др.). Его эффективность в качестве азотно-витаминной основы бактериологических сред превышала стандартные препараты пептонов, мясной воды, переваров Хоттингера, Мартена и др.
Доценко В. В. и соавт. (1995, 1996) разработали и испытали сухой белковый концентрат в качестве основы бактериологических питательных сред, в частности для культивирования P. mul-tocida шт. АВ и Sal. cholera suis шт. 177 и № 9. Ростобеспечиваю-щая способность сред на его основе для культивирования Е. coli, St. aureus, Str. faecalis, а также тест-микробов для контроля стерильности биопрепаратов С. diptheroides, Str. scarlatinae, CI. oede-matiens почти в 2 раза превышала этот показатель на мясной основе. Культивирование на средах с данной основой производственных штаммов рожи свиней, сальмонелл, пастерелл, бруцелл, кишечной палочки сопровождалось в 1,52 раза большим накоплением бактериальной массы, чем в контроле, с основой из мясного гидролизата.
Важным показателем, характеризующим степень пригодности той или иной белковой основы в составе конкретной среды, является содержание углеводов. Так, белковая основа должна быть свободна от углеводов в средах, предназначенных для дифференциации и идентификации микроорганизмов по их ферментативной активности в отношении того или иного углевода. С другой стороны, для успешного культивирования ряда микроорганизмов требуется наличие в среде определенных количеств углеводов. Высоким содержанием последних отличаются гидро-лизаты кормовых дрожжей. Пептоны (семипалатинский и «Dif-со») характеризуются достаточно низким количеством углеводов (Гавристова И. А., Бендас Л. Г., 1991).
1.3. Агар-агар и его заменители
«Агар» в переводе с малайского обозначает красные водоросли рода Eusheuma. Начало его использованию в бактериологии приписывают жене немецкого врача Fannie Hesse (Hitchens, Leikind, 1939). Более правдоподобной все же следует считать версию о том, что впервые агар ввел в практику микробиологии Роберт Кох. Агаровые среды сделали возможными многие открытия в микробиологии, например колонизация микроорганизмов для их дальнейшей изоляции и идентификации и т. д. На сегодня этот гелеобразующий агент общепризнан во всем мире и превос-
ходит по данному показателю в 8 раз животный желатин. Будучи расплавленным агар остается жидкостью при температурах выше точки застывания (36°С), что позволяет смешивать с культураль-ной средой, например, кровь при проведении гемолитических тестов. В то же время, застывший агар остается в твердом состоянии до температуры 85°С (точка плавления), позволяя исследовать термостабильные микроорганизмы, инкубированные при 60°С и выше. Различают американский и европейский подходы к использованию агара в микробиологических средах. В 1-ом случае к нему, как источнику, хоть и неизвестных, но необходимых, для роста многих бактерий и грибов микроэлементов, относятся положительно и допускается относительно низкая прочность геля (550850 г/см2), а, следовательно, более высокая концентрация агара и зольность менее 6,5%. Европейский подход рассматривает поступление, благодаря агару, неизвестных веществ в культуральную среду как крайне отрицательный фактор и, в связи с этим, возрастают требования к прочности геля (она должна составлять 8001100 г/см2), а, следовательно, допустимо снижение концентрации агара в среде и содержание золы менее 4,5%. Отечественный порошковый агар высшего сорта имеет прочность геля 350500 г/см2 (Семенов СМ., 1990). Разнообразие свойств агара различных серий влияет на ростовые свойства сред, например среды для выделения возбудителя чумы (Бурдо Л. И., 1979). Агар-агар подавляет активность у-гемолизина у St. aureus (Carlson E., 1986).
Как уже отмечалось выше, рецептуры полужидких сред содержат агар в качестве ингредиента в концентрациях 0,30,7%, а полуплотных и плотных средот 1 до 2%. Небольшие количества агара (0,050,3%) используются для определения подвижности и роста анаэробов и микроаэрофилов. Наличие незначительных количеств агара в бульонной среде ограничивает конвекционные потоки, позволяет варьировать степенью кислородного напряжения и способствует росту многих привередливых аэробных или анаэробных микроорганизмов. Добавление небольших количеств агара в среды для определения стерильности рекомендовалось Falk et al. (1939) и в дальнейшем эта идея была реализована в жидкой тиогликолятной среде для теста стерильности биологических объектов и антибиотиков в официальных процедурах. Известно более 20 видов микроорганизмов усваивающих агар (Семенов С. М., 1990).
Агарэто полисахарид и получается он из красных водорослей (Rhodophyceae). Агар обрабатывается для удаления химических и механических примесей, пигментированных кусочков и уменьшения солей до оптимальных концентраций. Наиболее высокоочищенным считается агар сорта Noble (США). Качество агара значительно влияет на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам (Семенов С. М., 1990) и зависит как от вида водорослей, так и от выбранного технологического режима
10
выделения (Шаповалова Н. И. и соавт., 1990). Используются водоросли родов Ceelidium, Gracilaria, Pterociadia, Anthopeltis и др. Поскольку в СССР (России) все виды агаров получают из красных водорослей p. Ahnfeltia, на качество их влияет только технология получения. Агар порошковый (ГОСТ 16280-70, сорт высший, рыбокомбината им. Набаидзе Приморрыбпрома) получают тепловым методом, а белый, вымороженный чешуйчатый (ГОСТ 6470-53) или микробиологический (ГОСТ 17206-84, сорт высший Корсаковского рыбоконсервного завода Сахалинрыб-прома)фростационным, при котором используется вымораживание и мягче условия экстракции. Фростационный метод применяется в СССР (России) на заводах Южного Сахалина и обеспечивает получение бесцветного агара более высокого качества (Промысловые водоросли СССР: Справочник. М., 1971). В зависимости от качества и предъявляемых к нему требований, различают агар микробиологический и пищевой (промышленный).
Отмечается отрицательный, и даже токсический, эффект агара на микроорганизмы (Андреева 3. М., Бобровникова А. Я., 1984; Ковалев Г. К., 1988) нейтрализуемый введением в питательные среды 1%-ой лошадиной сыворотки крови. В присутствии агар-агара в плотных средах увеличивается токсичность Sn. Из агара ингибиторные жирные кислоты можно адсорбировать древесным углем или крахмалом (Семенов С. М., 1990). Кроме того, агар-агар является достаточно дорогим и дефицитным компонентом. В качестве его заменителей предложены различные вещества, образующие гели, желирующее вещество Gelrite (Lin С, Casida L., 1984), сополимер полиол F 127 (Gardener S., Jones J., 1984; Ко М., Van Gundy S., 1988), полимеры Separan NP-10 и нейрогель, а также различные целлюлозные продукты (карбоксиметилцеллюлозы). Гашинский В. В. и соавт. (1987), Пивоваревич Л. П. и соавт. (1989) разработали плотные питательные среды где агар-агар заменяется синтетическим полимерным материаломмодифицированным полиакриламид-ным гелем (пластагаром), обладающим постоянством состава, высокими прозрачностью (>97% светопропускания) и прочностью (> 1200 г/см2)- Worsham P., Goldman W. (1988) при разработке двух плотных синтетических сред для культивирования дрожжевых форм Н, capsulatum использовали вместо агара ага-розу. Предлагаются методы получения безагаровых плотных питательных сред с использованием криогелей на основе природных и синтетических полимеров (Лозинский В. И., 1994). Для уплотнения среды Пименов Е. В. и соавт. (1997) рекомендуют комбинировать агар-агар с растительным полимером лихне-ином из лишайника Cetraria islandica, что позволяет снизить себестоимость среды и расширить ее сырьевую базу. Если предполагается гидролиз агар-агара, как его заменитель и уплотнитель среды используется силикагель.
В НИИ эпидемиологии и микробиологии (г. Владивосток) разработан новый эффективный метод изготовления высокоочищен-ного агара для микробиологических, вирусологических и иммунологических исследований, который по физико-химическим свойствам значительно превосходит отечественный и сопоставим с зарубежными («Difco», «Serva», «Ferak»). На созданном при институте предприятии «Медбиоагар» этот препарат выпускается под названием «Примагар» (Глазырина Т. А. и соавт., 1997).
Гриднева Н. И. и соавт. (1998) изучили образцы агар-агаров различных зарубежных фирм в плане использования в производстве питательных сред. По их данным, агары из Испании («His-panagar»), Марокко («Selexam») и Чили отвечают требованиям, предъявляемым к микробиологическим агарам (рН 7,07,4; прочность студня 340560; влажность 4,213,2%; температура затвердевания не выше 36°С). Итальянский агар фирмы «Blanco» можно использовать ограниченно для производства сред не требующих введения ex temporae каких-либо добавок (среды Левина, Гисса). Агар вьетнамского производства не годился для изготовления сухих сред, т. к. не отвечал требованиям ГОСТ по рН (6,2), температуре затвердевания (40°С) и биологическим свойствам (рост колоний тест-штаммов в R-форме).
Горобец О. Б. и соавт. (1998) сравнили пищевые агары зарубежных фирм. Наиболее мутные суспензии образовывали некоторые сорта агара из Марокко, Китая, Италии (фирма «Blanco») и Чили. Наиболее прозрачными оказались растворы агаров фирм «Copenhagen Pectin», «Blanco» (марки СК), «Franko», a также 1 сорт из Вьетнама. По культурально-морфологическим и биологическим свойствам выращенных бактерий наиболее близким к микробиологическому агару оказался сорт 800 А1 фирмы «Copenhagen Pectin» (Дания).
1.4. Сыворотка крови животных и человека
Сыворотка крови богата биологически активными соединениями, значение многих из которых в отношении микроорганизмов неясно. Она является также одним из источников железа, необходимого для многих видов бактерий. Особенности сыворотки крови разных видов животных и человека хорошо изучены. Показаны различия в белковом составе (Кармолиев Р. X., 1971) и других биохимических свойствах (Радаева И. Ф., Костина Г. А, 1998). При культивировании микобактерий для обогащения жидких питательных сред используют сыворотку крови различных видов млекопитающих. В нативном состоянии ее рекомендуют включать в среду для культивирования Lформ микобактерий туберкулеза Дорож-кова И. Р., Волк А. В. (1972) и Мордовской Г. Г., Птицына Е. А. (1982). По данным Mysak J. (1974) среда Банич с добавлением 10% сыворотки крови превосходит по культуральным свойствам среды

12
13
Левенштейна-Иенсена и Шула. Максимальное улучшение культу-ральных свойств жидких питательных сред отмечается при использовании крови (Dickinson J. et al., 1989) и сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) или V фракции бычьего сывороточного альбумина (БСА). Это среда Школьниковой с 10% сыворотки крови КРС и среда Миддлбрука (Middlebrook) без агара, но с добавлением комплекса олеин-альбумин-декстроза-каталаза. Хранение коммерческих сред, содержащих V фракцию БСА, ухудшает их культуральные свойства (Culter S., 1988). Бибергаль В. А. (1991) показала улучшение культуральных свойств среды Школьниковой в 9 раз при добавлении свежей человеческой плазмы. Можно, по ее мнению, использовать для этого и инактивированную сыворотку крови КРС. По данным Ильиных Л. А. (1990) при добавлении сыворотки крови КРС в среду Гельберга отмечается более ранний и интенсивный рост колоний микобактерий. Свежая сыворотка крови КРС в среде Middlebrook 7H11 ускоряла рост М. bovis (Galaciner J., Horwill D., 1977). Сыворотку крови КРС содержит среда Ренжа-ра для культивирования М. paratuberculosis (цит. по Сидорову М. А. и соавт., 1995). Среду для выделения микобактерий, содержащую сыворотку крови лошади, предлагают Дудницкий И. А. и соавт. (1991). Dhople A. et al. (1996) отмечают стимулирующий эффект на рост М. avium добавления в бульон 7Н9 сыворотки крови кроликов и людей, больных гемолитической анемией и гемохроматозом; тогда как сыворотки крови здоровых людей и больных микобактери-озом, вызванным М. avium, наоборот, оказывали угнетающее действие. Сыворотка крови лошади входит в состав среды ML для культивирования М. leprae (Osawa N., 1997). Среда VS3E, содержащая 30% сыворотки крови плода коровы (Bhatia V., Rao S., 1989), поддерживает рост М. leprae.
Нативную сыворотку крови лошади используют в питательных средах для пневмококков Балаян Л. Б. (1947); Бухарин О. В. и соавт. (1981).
Сыворотка крови входит в состав сред для нейссерий (Лабин-ская А. С, 1972; ГаджиеваА. Г. и соавт, 1982), в том числе менингококков (Руководство..., 1973; Шичкина В. П. и соавт., 1983). Общепринято выделение и культивирование последних на агаровых средах с 20% сыворотки крови лошади (Игонина Ю. А. и соавт., 1976; Костюкова Н. Н. и соавт., 1980). Используется и сыворотка крови КРС (авт. свид-во № 1659485, 1991). Учитывая процентное соотношение белков в асците, Андреева 3. М., Боб-ровникова А. Я. (1984) заменили его в соответствующих питательных средах для нейссерий сывороткой крови лошади. При этом, как отмечалось выше, ростовой эффект 1%-ой сыворотки объяснялся нейтрализацией ею токсического компонента агара. Шичкина В. П. и соавт. (1983) вводили в среду 1320% сыворотки крови животных. Татарников В. М. и соавт. (1984) показали низкую высеваемость менингококка на среде Гаджиевой в сравнении с 20%-ым сывороточным агаром Хоттингера и рекоменду-
ют добавлять в среду 10% нативной сыворотки крови лошади.
Османова М. М. и соавт. (1987) на жидких средах с разным содержанием сыворотки крови КРС показали защитный и стимулирующий механизм действия ее на рост гонококков. В результате оптимизации процесса культивирования получен рост тест-штаммов в бессывороточных средах. N. meningitidis формируют поли-сахаридную капсулу на плотных средах с добавлением нативной сыворотки, белки которой, однако, являясь балластными примесями, затрудняют процессы выделения и очистки препаратов, содержащих капсульный полисахарид. Скляр Т. В. и соавт. (1997) считают возможным замену в среде для культивирования N. gonorrhoeae сыворотки крови КРС на плазмол. Сыворотка крови человека и животных улучшает рост бледных трепонем. По данным Tokahashi К. et al. (1987) сыворотки крови человека и свиней инги-бируют активность гемолизина Т. hyodysenteriae.
Сыворотка крови млекопитающих удовлетворяет пищевые потребности большей части патогенных видов микоплазм в протеине, стероле, фосфолипиде и ацетонрастворимом липиде (Каган Г. Я., Раковская И. В., 1968). Наиболее широко используются для культивирования среды, обогащенные нативной сывороткой лошади. Выявленную непригодность сыворотки крови КРС Башмакова И. А., Солдатова В. М. (1971) связывают с низким содержанием в ней холестеринов и липидов. Кроме того, по их данным сыворотка крови человека эффективнее для выделения микоплазм.
Сыворотка крови лошади используется в среде для выделения Ureaplasma urealyticum (Гаджиева Г. Р. и соавт., 1989) и в среде U-9 (Raddi M. et al., 1992). Ее содержание в средах для микоплазм колеблется от 5 до 20% (Зуев В. В., 1971; Жеверже-ева И. В. и соавт., 1983; Барышникова П. И., 1994; Sikdar A. et al., 1992).
Ferreira N. (1993) допускает при инкубации М. gallisepticum на средах ТР и SS замену лошадиной сыворотки крови свиной, хотя 1-ая для дифференциации штаммов и анализа белков в ЭПАГ оказалась предпочтительней. Билько И. П. (1975) рассматривает использование сыворотки крови в питательных средах для получения биомассы микоплазм как отрицательное явление, вследствие необходимости многократного отмывания и концентрирования ее для освобождения от белков сыворотки. Эффективной для выделения гемокультур микоплазм оказалась среда Клодницкого с 0,01 %-ым цистином без добавления сыворотки крови животных (Клодницкая С. Н., 1976). О возможности культивирования М. canadense и М. verecundum в питательной среде для микоплазм без сыворотки, но с БСА, сообщают Graciela M., Sotomayor P. (1990), хотя интенсивность роста при этом была ниже. Breard A. (1990) рекомендует синтетический заменитель сыворотки крови при молекулярно-биологических исследованиях, но не для получения антигенов у микоплазм. По данным Okasa-

14
15
ki N., Fujiwara K. (1992) отдельные виды микоплазм чувствительны к микоплазмоцидному действию сыворотки крови лошади. Наибольшая активность выявлена по отношению к М. pneumoniae. Эффект проявлялся при 37°С в присутствии Са2+ и Mg2+. После прогревания при 56°С в присутствии комплемента эффект сохранялся в отношении М. pneumoniae и М. fermentans, но не в отношении М. neurolyticum и М. laidlawii. Установлено, что эта активность определяется комлексом lg G и М.
Сыворотка кроличьей крови в концентрации 530% является основным компонентом питательных сред для лептоспир. Малахов Ю. А. (1992) рекомендует использовать для их культивирования сыворотку крови животных только двух видов: кроликов и овец. Сыворотки крови КРС, баранов, лошадей и свиней обладают бактерицидным действием по отношению к лептоспирам (Ананьина Ю. В., Чернуха Ю. Г., 1983; 1984). Наиболее активно росту этих микроорганизмов способствует альбуминовая фракция. Некоторые исследователи рекомендуют использовать гемо-лизированную сыворотку, отмечая улучшение роста лептоспир при определенной степени гемолиза. Сыворотка крови или альбумин используются для детоксикации твинов в питательной среде.
Первоначально в нашей стране при промышленном производстве вакцины против лептоспироза микроорганизмы культивировали в среде Уленгута, состоящей из воды и кроличьей сыворотки крови. Замена в дальнейшем этой сыворотки на овечью не снизила качества вакцины. Однако переход в 1966 году биофабрики на альбуминовую среду ВГНКИ-1, где сыворотка была заменена ее альбуминовой фракцией вызвал ухудшение антигенных свойств лептоспир и с 19751976 годов для культивирования вновь стали использовать водно-сывороточную среду с овечьей сывороткой. Затем было установлено отрицательное влияние на рост лептоспир спонтанно встречающихся в сыворотках крови овец-доноров гомологичных антител и на биофабрике внедрили комбинированную сывороточно-альбуминовую среду, которую применяют и в настоящее время (Ситьков В. И. и соавт., 1996). За рубежом же для этих целей используют бессывороточные полусинтетические (альбуминовые) или синтетические питательные среды.
Сыворотку крови различных видов млекопитающих добавляют в среды для спорификации патогенных и непатогенных микробов (Sementini А., 1942), в частности, В. anthracis (Srinivasan V. et al., 1972). Кровь и ее сыворотка адсорбируют ингибиторы капсу-лообразования питательной среды (Schaefer W., 1963). Роль последней в образовании капсул у вирулентных штаммов В. anthracis изучали Meynell E., Meynell G. (1964). Нативные бычья или лошадиная сыворотки в относительно высокой концентрации являются обязательными компонентами многих элективных сред, предназначенных для капсулообразования В. anthracis (ГКИ; Томова; Шляхова, 1973; Низамова Р. Н. и соавт., 1992; Лефлера; сыворо-
точных агара и бульона). Левина Е. Н. и соавт. (1974) с целью накопления токсина В. cereus использовали среду Торна с добавлением, помимо других компонентов, 1% сыворотки крови.
Кровь КРС, а чаще ее сыворотка, входят в состав питательных сред для культивирования бруцелл (Колесникова Н. С, 1961; Альтон Дж., Джонс Л., 1968). Как заменитель сыворотки для повышения ростовых качеств среды для бруцелл используют твин-40. В отличие от других (шероховатых форм) бруцелл штамм Br. ovis И-65 (гладкий вариант) растет только на питательных средах с нативными сыворотками крови КРС или лошади (Тарасова Т. А. и соавт., 1983).
Для культивирования Campylobacter pylori используют различные кровяные среды с добавлением 510% бараньей, лошадиной или человеческой крови и (или) сыворотки (Баженов Л. Г., 1991). Xia H. et al. (1992, 1993) отмечают, что в сердечно-мозговом бульоне с 10% лошадиной сыворотки крови С. pylori сохраняются более 3 сут. Schulze E et al. (1987) выделяли и дифференцировали бактерии рода Campylobacter на агаре Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton) с добавлением 10% телячьей крови.
Allan Е., Poxton 1. (1994) показали влияние среды культивирования на чувствительность различных видов Bacteroides к бактерицидному действию комплемента сыворотки крови человека и экспрессию поверхностных структур. Изученные штаммы были в различной степени чувствительны к сыворотке когда культивировались в обогащенной среде с протеозным пептоно-дрожже-вым экстрактом. Однако при выращивании в минимальной среде Van Tassell и Wilkins, половина штаммов проявляла ощутимую устойчивость как к человеческой, так и к инактивированной бараньей сывороткам крови.
Для культивирования возбудителя американского гнильца пчел (Вас. larvae) в настоящее время широко используют МПА с добавлением 10% лошадиной сыворотки крови без консерванта, хотя и на ней Вас. larvae не всегда хорошо растет.
Савельев Е. П. и соавт. (1989) изучали влияние на рост стрептококков группы А добавления в среду культивирования фракций сыворотки крови КРС, содержащих низкомолекулярные соединения. Griffiths В., McClain О. (1987) показали восстановление инга-бированной ионами Fe3+ продукции гемолизинов Str. pyogenes при добавлении в среду сыворотки. По данным Shimokawa О. et al. (1994) сыворотка крови лошади подавляет рост L-форм St. aureus, а редкие колонии, выраставшие на среде, обогащенной данной сывороткой, являются стабильными L-формами. Ivanova E. et al. (1991) культивировали стабильные L-формы протопластов Е. coli WE+ на соевой среде с 10% сыворотки.
По данным Evans M. et al. (1986) добавление сыворотки крови человека к бульону Мюллера-Хинтона приводит к появлению 1450% ложноположительных результатов чувствительности Ps. aeruginosa к моксалактаму. Значительно возрастает чувствитель-

16
I7
ность Ps. aeruginosa к сыворотке крови человека при выращивании на Mg-дефицитной среде (Tzouvelekis L. et al., 1990).
Кравцов А. Н. и соавт. (1987, 1992) показали связь остановки роста Y. pestis в нативной сыворотке крови с ограничением поступления железа в микробную клетку. Выяснено, что гемин Y. pestis в сыворотке не используют. Предполагается ассимиляция железа трансферрина зависящая от температуры и осуществляющаяся только при 28°С. Инкубация в сыворотке крови человека способствует обогащению антигенной структуры возбудителя чумы, повышая тем самым вирулентность и иммуногенность.
Пастереллы на средах без сыворотки растут не всегда удовлетворительно, поэтому в бактериологической диагностике пасте-реллеза рекомендуется использование сывороточных МПА и МПБ, а также сывороточных бульона и агара Хоттингера в состав которых входят 10% нативной сыворотки крови лошади (Метод, указания ..., 1992).
Наличие цистиназыосновного видового признака С. dipt-heriaeопределяют на среде Пизу с 10% лошадиной сыворотки. Батурина А. В. и соавт. (1990) заменили в ней лошадиную сыворотку на среду 199. Отсутствие сыворотки крови в агаровой среде не сказывается на качестве тестирования токсигенности дифтерийных культур, причем наилучшей из заменителей сыворотки (твин-40, ГЛА, аминопептид, протеин) оказалась среда 199 (Гази-зова Г. Р. и соавт., 1990).
Сидоров М. А. и соавт. (1995) отмечают лучший рост актино-мицетов A. pyogenes и A. hardeovulneris на сывороточных средах. Сыворотка крови кролика входит также в состав среды Бейгтона, Колмана (1976).
Пушкарева В. И. и соавт. (1997) показали реверсию покоящихся листерий в вегетативное состояние под воздействием фе-тальной сыворотки.
Castaneda E. et al. (1988) отмечают эффективность наличия в среде культивирования лошадиной сыворотки крови при выделении Paracoccidioides brasiliensis и объясняют это содержанием в ней сидерофоров.
Поданным Ожередовой Н. А. (1997) стимулирующий эффект сыворотки крови рыб на рост и размножение С. albicans выше, чем кроличьей.
1.5. Твины
Твиныэто детергенты (поверхностно-активные вещества, которые, расщепляя молекулы белка или жира на различные соединения, проникают в жировую и казеиновую пленки). В небольших концентрациях твины обеспечивают рост культур микроорганизмов не изменяя их морфологических и биологических свойств (Карташова В. М., 1973). В то же время, имеются данные
о специфических изменениях в структуре клеточных стенок и цитоллазматических мембран у L. monocytogenes, Sal. typhimuri-um, Ps. aeruginosa и Ps. pseudomallei при обработке их 0,5 и 1% твин-20 (Cherepova N., Veljanov D., 1994).
Бруцеллы разных видов способны гидролизовать твины (Рыкова В. И., Домарадский И. В., 1963) и в качестве компонентов питательных сред для их выращивания рекомендуются твин-40 (АльтонДж., Джонс Л., 1968),твин-60(ГрушинаТ. А., 1975, 1978) и твин-80 (Бакулов И. А. и соавт., 1993) с целью замены сыворотки и повышения ростовых качеств сред.
Крылова М. Д. (1969, 1972) при культивировании Corynebacte-rium diptheria добавляла к мартеновскому бульону 0,02% твина-80. Collins (1986) рассматривает способность к гидролизу твина-80 у С. cystitidis как признак, позволяющий дифференцировать его от С. renale и С. pilosum, которые такой способностью не обладают.
Бузолева Л. С, Пручкина 3. В. (1990) для выявления липазы у бактерий кишечной группы (шигелл и сальмонелл) после предварительного засева в различные среды богатые органическими веществами, вторым этапом высевали инокулят на плотные агаровые среды с твинами-20, -40 и -60, являющиеся субстратами биохимических реакций, лежащих в основе определения липазы бактерий. Показано значительное снижение активности липазы с увеличением концентрации твинов. Авторы предполагают, что увеличение содержания твина в реакционной среде резко снижает эффективность процесса гидролиза.
По данным Akbulut N. et al. (1994) для выделения и дифференциации Y. enterocolitica агар МакКонки модифицированный с твином-80 оказштся эффективнее сред МакКонки: SS; висмут-сульфитной с бриллиантовым зеленым; желчной с фиолетовым красным и дезоксихолатной.
Аэробный питательный агар-среда для Bacteroides fragilis (Петраков А. А., 1982) содержит твин-80. Для упрощения процедуры выделения Вас. fragilis предлагается готовить среды на основе сухой среды для контроля стерильности производства ЦНИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва) с добавками гемина, витамина К, твина и др. (Петраков А. А., 1982; Баженов Л. Г., Исхакова X. И., 1985).
Большинство видов рода Serratia (энтеробактерии) способны гидролизовать твин-80, исключение составляет Sen odorifera.
Твин-80 входит в состав жидкой синтетической среды № 7 для выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала (Bernhardt С, Rentgen H.. 1975). Для их культивирования и фаго-типирования Garcia-Rodriguez J. et al. (1986) эффективно использовали среду RVB с твином-80. Между тем, еще в 1953 году Bloch и Noll показали слабовирулентность микобактерий туберкулеза, выращенных на среде с твином-80, и восстановление вирулентности при пересеве на среды без него (цит. по Кравченко М. А., 1984). В средах с твином-80 с потерей гидрофобности наблюдается диффуз-

18
19
ный рост микобактерий (Сидоров М. А. и соавт., 1995). Способность к гидролизу твина позволяет дифференцировать отдельные виды микобактерий (Lawrence, Kubica, 1986). Кроме того, твин-80 ингибирует рост микобактерий (Thomas С. et al., 1989). По данным Masaki S. et al. (1990, 1991) 0,05% (0,5 мг/мл) или более твина в жидкой среде оказывает бактериостатическое действие, приводит к удлинению клеток М. avium, уменьшает содержание в них гликоли-пидов, а также изменяет результаты биохимических тестов на ре-дуктазу нитратов, уреазу и арилсульфатазу. В то же время, твин-80 и аналогичные ему сурфактанты потенцируют действие антибиотиков на М. avium, что объясняется действием его непосредственно на клеточную стенку данного микроорганизма. Шим Н. В. и соавт. (1989) рассматривают твин-80 как агент, вызывающий L-трансфор-мацию микобактериальных клеток.
Признаком, дифференцирующим Erysipelothrix rhusiopathie (возбудителя рожи свиней и эризипелоида людей) от бактерий сходных родов, является неспособность к гидролизу твинов-20 и -80, тогда как листерии их гидролизуют, а у коринебактерий, лак-тобацилл и др. этот признак не определялся (Сидоров М. А. и соавт., 1995).
Твин-80 входит в состав сред Рогоза и МРСдля культивирования Lactobacillus; среды Бриге в модификации Шарпдля культивирования Pediococcus и среды для определения псевдока-талазы (ГОСТ 1044.11-89).
Из ряда сред использованных Lorenzini R., Bernardis F. (1987) для культивирования, идентификации и сохранения грибов Malassezia pachydermatis наиболее пригодным оказался сахарный агар, обогащенный 1,5% дрожжевого экстракта и 1% твина-80. Предложена среда для идентификации Candida albicans и Crypto-coccus neoformans, содержащая твин-80 и желчь (J. Clin. Microbiol., 1977, v. 5, p. 236243). При сравнительном изучении 4 питательных сред Kurup V. et al. (1986) установили, что для получения бластоспор из мицеальной формы возбудителя североамериканского бластомикоза (Blastomyces dermatitidis) наиболее пригодна альбумино-казеиновая среда с твином, на которой обнаруживали характерные клетки с единичными почками. Waller J. et al. (1991) для поиска хламидоспор С. albicans производили посев на агаризованную среду с твином-80.
Волина Ё. Г. и соавт. (1982) изучали динамику формирования колоний лептоспир на средах, содержащих твин-80. Один из наиболее эффективных и экономически доступных источников жирных кислот, необходимых лептоспирам,водорастворимые липиды. Из последних предпочтительны полисорбаты, к которым относятся твины 2080эфиры соответствующих жирных кислот. Содержание последних в них следующее (%):
твин-80: олеиновая кислота64,45; линолевая21,86; пальмитиновая7,64; пальмитоолеиновая1,89; стеариновая1,44 и линоленовая0,68;
твин-60: стеариновая кислота64,26; пальмитиновая33,96; гептодекановая1,58; миристиновая0,84 и арахиновая0,14;
твин-40: пальмитиновая кислота94,77; стеариновая2,88; миристиновая1,68; каприловая0,125; лауриновая0,126 и пентадекановая0,229;
твин-20: лауриновая кислота55,16; миристиновая24,26; пальмитиновая9,46; каприновая4,65; каприловая3,88 и стеариновая1,23 (Ellinghausen, 1983).
Однако твины содержат определенное количество свободных жирных кислот (твин-80до 3%), токсичных для лептоспир. Простейший способ их детоксикациидобавление к среде сыворотки крови или альбумина в обычных концентрациях или соединение твина с мелким порошком древесного угля, который хорошо адсорбирует все токсические примеси.
Оптимальная концентрация твина-60 в сложной среде составляет 200300 мкг/л; для смеси твина-60 и твина-80 концентрация каждого компонента равняется соответственно 200 и 50 мкг/мл.
Для культивирования лептоспир предложены твин-альбуми-новые среды Ellinghausen, McCullogh в модификации Johnson, Harris (1967) и Russel E, Russel С. (1986), а также твин-альбумин-сывороточная среда Эллиса для выделения L. interrogans и усовершенствованная элективная среда для выделения лептоспир из контаминированного материала (Adler В. et al., 1986).
Белоусов В. И., Тюрина И. Н. (1996) показали возможность выращивания производственных штаммов лептоспир на твин-альбуминовой среде с использованием отечественных компонентов. Очищенный на ионообменной колонке отечественный твин-80 по качеству превосходил таковой фирмы «Merck». При промышленном культивировании оказался годным и неочищенный твин, но для его детоксикации на 0,25% в среду необходимо было добавлять не менее 0,2% альбумина.
Из жидких сред наиболее эффективной для накопления бак-териоцинов Bord. pertussis оказалась по данным Бакулиной Н. А. и соавт. (1980) среда типа Коэн-Уилера с добавлением 0,1% твина-80.
Kelly M. et al. (1988) провели комплексное двухэтапное исследование по оценке 4 сред для выделения шт. Aeromonas из фекалий, в том числе агара МакКонки, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1% твина-80.
1.6. Минеральные соли
Готтшалк Г. (1982) выделяет 10 химических элементов, требуемых для микроорганизмов в высоких концентрациях (С, О, Н, N, S, Р, К, Mg, Ca, Fe), минорные незаменимые элементы (Zn, Mn) и ряд элементов, необходимых только для отдельных

20
21
микроорганизмов с особым типом метаболизма (Se, Mo, Co, Cu,W).
Соли кальция и магния могут изменять чувствительность микроорганизмов к антибиотикам (Чайковская С. М. и соавт., 1981).
Подробный анализ лимитирования и ингибирования жизнедеятельности микроорганизмов ионами металлов (Fe, Ca, Mg, Мп) дали Мельникова В. А. и соавт. (1991).
Показана высокая чувствительность бактерий рода Pseu-domonas к солям Ва2+ (Сиволодский Е. П., 1988; Смирнов В. В., Киприанова Е. А., 1990). Угнетающее действие ионов бария ослабляется или устраняется ионами кальция и магния (но не марганца, кобальта, молибдена, меди и железа). Предполагается, что ионы бария являются антагонистами некоторых дивалентных катионов, играющих важную роль в стабилизации наружной мембраны.
Mustafa R, Whittenbury A. (1970) показали устойчивость ряда фитопатогенных псевдомонад, в отличие от флуоресцирующих сапрофитов, к солям марганца и чувствительность к солям кобальта.
В состав среды для Ps. aeruginosa, разработанной в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва), входят минеральные соли магния, калия (Мороз А. Ф. и соавт., 1976). Ионы К* облегчают образование у данных микроорганизмов пигментов (Якубчак О. Н., 1997). Для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. По этой причине в среды для Ps. aeruginosa вводят K2SO4 в диапазоне концентраций от 7 (селективная среда РЧЖ)8 г/л (среда PFA Gill У, Stock E, 1987)до 10 г/л (среда Кинга A); MgSOoв диапазоне от 0,2 (среда с ацетамидом) и 0,5 г/л (среда Паллерони-Дау-дарова) до 1,5 г/л (среды РЧЖ и Кинга В). В селективную среду для Ps. aeruginosa Федориной А. П. (1987) входит 0,220,66 мг/мл сульфата цинка. Ряд неорганических солей содержит среда культивирования Аджиевой А. А. и соавт. (1987). Содержание КгНРСЬ колеблятся в диапазоне от 0,3 (среда Хью-Лейфсона) до 1 (среда с ацетамидом) и 1,5 г/л (среда Кинга В).
По данным Tzouvelekis L. et al. (1990) недостаток Mg стимулировал продукцию белка HI всеми штаммами Ps. aeruginosa и снижал уровень синтеза ЛПС без изменения качественного состава последних. Выращенные на Mg-дефицитной среде Ps. aeruginosa проявляли повышенную чувствительность к сыворотке, расход Сз-компонента комплемента был снижен. Кроме указанного MgSOi, в среды в качестве соединения, содержащего ионы Mg2+, вводят MgCb в количестве 1,4 г/л (цетримидный агар, среда Кинга А) и 1,5 г/л (среда РЧЖ). По Blumentals J. et al. (1987) добавление в среду культивирования MgSO-t, ZnSO и CuSOi не влияло на синтез экзотоксина Ps. aeruginosa. Ионы Fe2+ тормозили, а ионы Са2+ усиливали синтез экзотоксина А, причем повышение кон-
22
центрации Са2+ с 25 до 500 мМ увеличивало выход экзотоксина как минимум в 3 раза. Добавление в среду СоСЬ снижало выход экзотоксина на 60%. В состав сред Хью-Лейфсона, МакКонки и среды с ацетамидом входит NaCl в количестве 5 г/л.
Кулаев И. С. и соавт. (1987) отмечают отрицательное влияние на синтез Ps. lytica фермента, обладающего бактериологической активностью в отношении ряда грамположительных микробов, некоторых солей в концентрациях, используемых обычно для приготовления питательных сред.
Вульфдитер Ш., Петер К. (1992) предлагают для получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы культивировать соответствующие микроорганизмыпродуценты из рода Pseudomonas (Ps. putida) на питательной среде, содержащей минеральные солисульфат магния, фосфаты натрия двузамещенного и калия однозамещенного, а также соединения железа и хлора.
Марцинкявичене Л. Ю. и соавт. (1991) отмечают повышение активности и чистоты холестеринэстеразы при культивировании его продуцентаPs. mendocina ВКПМ В-2173 на среде, содержащей 0,52,5 г/л фосфата калия двузамещенного; 0,50,8 г/л се-миводного сульфата магния; 0,30,8 г/л хлорида калия и 13 г/л нитрата натрия.
По данным Бойкова Ю. Н. и соавт. (1991) выход и активность рестриктазы Psu 1 возрастают при культивировании Ps. stutzeri ВКПМ В-4724 в питательной среде, содержащей 12 г/л сульфата аммония; 0,50,7 г/л цитрата натрия и 0,0010,002 г/л хлорида железа.
Иванов Ф. М. (1967) разработал полужидкую обогатительную среду, в состав которой входили 2 г/л фосфата натрия однозамещенного; 2 г/л цитрата натрия и 0,6 г/л гипосульфита.
Maudsley J., Kadis S. (1986) разработали синтетическую среду для культивирования гемолитически активных бактерий Н. pleu-ropneumoniae. Несмотря на снижение ростовых свойств, концентрация внеклеточного гемолизина на ней была в 810 раз выше, чем на среде с соевым гидролизатом и 0,6% дрожжевого экстракта, а также бульоне на сердечной вытяжке (контрольные среды). Продуцируемый гемолизин является термолабильным белком, активность которого зависит от концентрации в среде ионов железа в определенных фазах роста бактериальных культур.
Vanden В. (1987) на основании значительного улучшения ростовых свойств среды для 19 испытанных штаммов Н. ducreyi при добавлении 0,01 мкг/мл селенита натрия сделал предположение о влиянии на высеваемость этого микроорганизма неодинакового количества селена в образцах крови, сыворотки и воды, используемых для приготовления сред.
Wooten J. et al. (1987) показали использование в качестве источников железа бактериями Н. influenzae гема, гемоглобина, миоглобина, гемоглобин-гаптоглобина и насыщенного на 30% человеческого трансферрина, но не лактоферрина.
23
Pidcock K. et al. (1988) на определенной среде с ограниченным содержанием железа изучали влияние гемина и других (не из крови) источников железа на рост Н. influenzae типа b и нети-пируемых штаммов. Использовали железо из гемина, гемоглобина, гемоглобин-гаптоглобина, гемин-гемопексина. Рост усиливался частично очищенным человеческим трансферрином, но не лактоферрином или ферритином. Очищенный ферриентерохо-лин и ферридесферриоксамин не влияли на рост этого микроба. По данным Gorringe A. et al. (1991) при дефиците железа в ростовой среде у Bord. pertussis и Bord. parapertussis появляются новые мембранные белки и сидерофоры, обеспечивающие перенос ионов железа с трансферрина бактериальной клетке.
В низких концентрациях бикарбонат натрия стимулировал, а более высокихингибировал размножение мелких спирохет (Fiehn N.-E., 1989).
Малахов Ю. А. (1992) рассматривает потребность лептоспир в минеральных соляхисточниках Mg, Ca, Mn, Fe, Zn, К.
В качестве селективной при исследовании загрязненных проб используется среда с мочевиной и солями кобальта (Росто-мянС. В., 1973).
Для дифференциации лептоспир наибольшее применение нашел бикарбонатный тест: патогенные лептоспиры, в отличие от сапрофитных, не растут на средах с NaHCO. Используются также тесты со средами содержащими соли меди, сулемы, лития, нитрата кобальта и серебра (Троп И. Е., Бутакова А. Е., 1976). Daok G. et al. (1961) изучали питательную потребность Т. pallidum в дивалентных ионах.
Pekala D., Padgett P. (1986) исследовали рост и микроаэро-фильную природу видов Borrelia при культивировании в среде А с добавлением соединений, детоксицирующих супероксидные и гидроксильные радикалы, перекись водорода, атомарный кислород. Из испытанных диметилсульфоксида, формата натрия, ман-нита, дитиотреитола и активированного угля, первые два оказались наиболее эффективными стимуляторами роста боррелий. Хороший результат получен также при комбинации хлорида железа и метабисульфита калия в концентрации 0,002%.
По данным Sarafian S., Morse S. (1986) продукция токсина-1 синдрома токсического шока шт. St. aureus 1169 в синтетической безуглеводной среде возрастает при увеличении концентрации ионов Mg2+ до 2,0 мМ, а при дальнейшем увеличении концентрацииснижается. В анаэробных условиях концентрация ионов Mg2+ не влияла на синтез токсина. Между тем, отмечается независимость процессов синтеза токсина и роста микроорганизмов друг от друга.
Несколько иные результаты получены Taylor D., Holland К. (1988), наблюдавших в условиях дефицита ионов Mg2+ (100 мкМ) заметное снижение скорости роста популяции St. aureus и продукции токсина по сравнению с культурой, выращиваемой при
24
избытке ионов Mg2+ (1 мМ). Использовалась синтетическая среда, в состав которой входило 6 аминокислот, глюкоза, 2 витамина и соли.
James J. et al. (1989) также изучали влияние магния на продукцию in vitro токсина-1 St. aureus. Предварительно выращенные на триптиказо-соевом агаре колонии St. aureus суспендировали в среде без Mg2+ и после отмывания инкубировали в синтетической среде с Mg2+ в концентрации от 4,6 мМ до 0,033 мкМ при ограниченном содержании либо валина, либо триптофана, в аэробных и анаэробных условиях. Mg2+ влиял на размножение St. aureus и продукцию ими токсина-1. Специфическая активность токсина-1 увеличивалась с ростом концентрации Mg2+ и была максимальной при физиологических уровнях Mg2+. При анаэробных условиях St. aureus росли, но не продуцировали токсин-1. В ферментере при содержании валина в среде не более 10 мкг/мл его продукция и специфическая активность повышались с уменьшением концентрации триптофана, независимо от концентрации Mg2+ в среде. Таким образом, не удалось подтвердить предположение о специфическом контролирующем действии Mg на продукцию токсина-1 St. aureus in vitro.
Bhat К. et al. (1994) установили необходимость для начала роста St. aureus не менее 0,01 мМ Mg2+ в среде и усиление роста при увеличении его концентрации до 1,6 мМ. Причем от содержания этого иона в среде зависят утилизация глюкозы, кислотный синтез, и он мог снижать ингибиторный эффект избыточного содержания Со и Zn на рост St. aureus.
Yabu К. (1986) разработал эффективный метод получения L-форм St. aureus при 30°С в инкубационной жидкой среде, содержащей осмотические протекторы (сульфат магния, хлорид натрия) в сочетании с L-трансформирующими агентами.
Для развития самых различных видов бактерий в деминерализованной синтетической среде требуется от 0,3 до 4 мМ железа (Dhople A. et al., 1996). Одним из его источников в среде культивирования является сыворотка крови.
Известна непосредственная связь патогенности микроорганизмов с их способностью усваивать железо из организма хозяина, основными источниками которого являются белки лакто-феррин и трансферрин. Большинство бактерий для утилизации железа синтезируют специальные, обладающие высоким сродством к нему, низкомолекулярные соединениясидерофоры. Виды патогенных бактерий способные утилизировать железо непосредственно из лактоферрина и трансферрина без предварительного синтеза сидерофоров единичныэто N. gonorrhoeae, N. meningitidis и Н. influenzae. Кроме того, в качестве не-сидерофоробразующих отмечаются М. pneumoniae, Trichomonas vaginalis и Bacteroides fragilis. Перечисленные нейссерии могут использовать в качестве источника железа только определенный тип трансферрина, а именно человеческий. Механизм усвоения
25
железа несидерофоробразующими бактериями мало изучен. Предполагается, что для нейссерий основной стадией утилизации железа является биосинтез специфических железорегулиру-ющих белков-рецепторов, интенсивно синтезируемых в условиях дефицита железа в среде культивирования (Филатова Т. Н. и соавт., 1995).
В плотных средах для L. pneumophila оптимальное содержание пирофосфата железа равно 0,25 г/л, тогда как в жидких его концентрация может быть уменьшена (Ristoph J. et al., 1981; Warren W, Muller R., 1981) или же этот компонент вообще может отсутствовать (Костюченко В. И. и соавт., 1985). Соли NaCl, MgSO, Ca(NCb)2, (NH4)2S04, Fe4(P207)3 в концентрациях 10-50 мг/л незначительно стимулируют рост L. pneumophila и продукцию им термолабильного токсина, тогда как NaHCCh в количестве до 100 мг/л не влиял, a ZnS04 и МпСЬ уже в концентрациях 20 и 100 мг/л, соответственно, подавляли оба процесса (Белый Ю. Ф. и соавт., 1986).
Рублевым Б. Д. и соавт. (1988) показана возможность ограничения роста бактерий чумы уровнем содержания железа в питательной среде. Вирулентные штаммы обладали более выраженным механизмом ассимиляции его по сравнению с вакцинным. Ионы железа извлекаются при контакте поверхности клеток с железонасыщенным трансферрином.
Esteve С, Amaro С. (1991) изучали образование сидерофоров у Aeromonas spp. выделенных от европейского угря. Условия с ограниченным содержанием железа получали добавлением хелатных соединений, содержащих железо (ЭДДА). Минимальные ингиби-торные концентрации (MlС) ЭДТА и образование сидерофоров были продемонстрированы на хром-азурол-S (CAS)-arape. Все исследованные штаммы были способны расти при низком содержании железа. Хелатные типы сидерофоров производили все виды и были функционально связаны с энтеробактином.
Simpson L. (1987) изучала способность V. vulnificus компенсировать недостаток железа использованием связывающих этот элемент белков. Изученные штаммы не были способны извлекать железо из недостаточно насыщенных им лактоферрина или ферритина, при полном же насыщении железом этих белков рост бактерий усиливался. Ни один штамм не усваивал железо из 30% насыщенного трансферрина, но они различались по способности усваивать его из полностью насыщенных форм. Вирулентный штамм, в отличие от авирулентного, более эффективно использовал трансферрин при условии полного насыщения его железом.
Минимальное количество железа, необходимое для полного роста микобактерий, колеблется в пределах 14 мМ. Dhople A. et al. (1996) связывают интенсивность роста М. avium с уровнем насыщения трансферрина железом: высокое содержание железа стимулирует рост данного микроорганизма.
Предполагается регулирующая роль кальция в разнообразных внутриклеточных процессах у прокариот, в том числе в развитии, дифференциации и споруляции у актиномицетов (Иванова И. В. и соавт., 1994; Daza A. et al., 1989; Natsume M., 1989). Инициирование спорообразования объясняют нарушением кальцием внутриклеточного фосфатного равновесия в сторону снижения по причине образования нерастворимых фосфатов кальция. Эффективность влияния кальция зависит от концентрации его свободных ионов, вследствие чего в связанном виде, например в форме карбоната, он практически не воздействует на дифференциацию актиномицетов (Иванова И. В. и соавт., 1994). Биологическое действие кальция основано на его структурных свойствах, благодаря которым он способен связываться с большими полимерными молекулами, а также образовывать комплексы с низкомолекулярными анионами и нейтральными лиганда-ми (Kazmierczak J., 1986).
По данным Волковой В. П. и соавт. (1985) из минеральных солей наиболее способствуют споруляции В. anthracis соединения магния и марганца, причем последний обладает подобным эффектом и относительно многих других видов бациилл (Hodges N., Brown R., 1974; Oh Young, Freese E., 1976; Перт, 1978; Смирнов В. В. и соавт., 1982).
Edwards R. et al. (1997) показали влияние ионов цинка на активность металло-р-лактамаз у Bact. fragilis. Наибольшая активность фермента отмечалась при концентрации сульфата цинка 50500 мкМ. Добавление Zn в среду увеличивает образование CdS-частиц, определяющих токсичность К1. pneumoniae (Holmes J. et al., 1997).
Отмечается увеличение токсичности ионов Zn хлоридом натрия, Snагар-агаром и уменьшение токсичности Cd хлоридом натрия, Sn, Cd, Pb, Ni и Znсиликагелем, Cd и РЬфосфатами, Pbкарбонатами. Ингибиторными свойствами обладает комплекс меди с пептоном (Bridson E., Brecker А., 1970). Кожо-карь Э. И. и соавт. (1991) предлагают в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры при выращивании грибов использовать 0,550,76 г/л хлорида кадмия.
По Zaika L. et al. (1997) добавление поливалентных ионов металлов в среду культивирования L. monocytogenes, например среду BHI, содержащую полифосфат натрия предотвращало инги-бирующее действие последнего на данный микроорганизм.
1.7. Селективные агенты Красители
Чувствительность к красителямодин из критериев в систематике микроорганизмов. Для их дифференциации на специаль-

26
27
ных питательных средах используются в основном анилиновые красители. Имеются сообщения о применении красок и для выявления факторов патогенности различных бактерий (Григорьева Л. В. и соавт., 1991).
Многие красители вводятся в состав сред в качестве индикаторов рН с целью выявления биохимических свойств микроорганизмов по изменению окраски среды. Сведения о диапазонах определения рН и особенностях изменения цвета различных красителей представлены в каталоге продукции фирмы «Becton Dickinson» (1988) и в монографии Семенова С. М. (1990).
Широкое применение нашел краситель конго красный для определения вирулентности Sh. flexneri (Daskaleros P., Payne S., 1987; Qadri F. et al., 1988), иерсиний (Riley G., Toma S., 1989) и условно патогенных энтеробактерий, в частности Е. coli (Поликарпов Н. А. и соавт., 1990; BerkhoffH., Vinal A., 1986). Вирулентные штаммы данных микроорганизмов связывали конго красный из агаровой среды. В 1988 г. такое же свойство было выявлено BerkhoffH., Vinal А. у трипанового голубого, Calcofluor, Jinopal и бриллиантового желтого.
Синтетическая среда для выявления вирулентных штаммов чумного микроба по признаку пигментации (Инструкция по применению..., 1990) включает 0,03 г/л конго красного.
Для идентификации и дифференциации Y. enterocolitica, обладающих плазмидой вирулентности от утративших ее, Bhaduri S. et al. (1991) предлагают метод, основанный на связывании конго красного при лимитировании Са2+. Несколько раньше, как уже отмечалось, Bhaduri S. et al. (1987) для выявления вирулентности Y. enterocolitica успешно использовали кристаллический фиолетовый.
Конго красный входит в состав дифференциально-дигно-стический среды № 67, предложенной Серовым Г. Д. (1966, 1969) для выделения Y. pseudotuberculosis и рекомендуемой также для выделения Y. enterocolitica (Ценева Г. Я. и соавт., 1993). Несмотря на высокую селективность, из-за дефицита конго красного (Кузнецов В. И., 1991) и других трудностей в практических лабораториях она применяется мало. В состав полужидкой среды для иерсиний Погореловой Н. П. (1984) входит бромтимоловый синий. Для выявления вирулентности Y pestis (Маевский М. И. и соавт., 1988) и Y enterocolitica (Bhaduri S. et al., 1987) предлагается кристаллический фиолетовый. Высокой селективностью и чувствительностью для иерсиний отличается дифференциально-диагностическая среда Кузнецова В. И. (1991), в состав которой входят кристаллический фиолетовый и бромтимоловый синий. Последний краситель является и компонентом плотной дифференциально-диагностической среды БТС (Ценева Г. Я. и соавт., 1991, 1993; Мессорош В. Г., 1994). Cipriano R., Pyle J. (1985) определяли утилизацию сор-
бита штаммами Y. ruckeri на среде с 24 мг/л фенолового красного.
Плотная дифференциальная среда для одновременного выявления кальцийзависимости и пигментосорбции, разработанная Саямовым С. Р. (1994) на основе 10-кратного концентрата среды 199, содержит 3 мг% трипанового синего в качестве сорбируемого пигмента.
Генциановый фиолетовый рекомендуют использовать в разработанных ими средах для чумного микроба Степанов В. М., Радченко Г. А. (1986), Реброва Р. Н. и соавт. (1986), Васильева 3. И. и соавт. (1992) с целью повышения ростовых свойств и селективности.
Waters G. et al. (1988) предложили выделять патогенные шт. Y enterocolitica из мясных продуктов на среде обогащения ITC, содержащей малахитовый зеленый.
По данным Сох N. et al. (1990) оптимальным для выделения Y. enterocolitica является сочетание бульона Шейманна, включающего бенгальский розовый и фосфатно-буферного раствора с пектиновым или цефсулодин-иргазан-новобиоциновым (CIN, в русской транскрипцииЦИН) агарами.
Сравнение выделяемости Y. enterocolitica выявило большую эффективность агара МакКонки, модифицированного с тви-ном-80 по сравнению со средой с бриллиантовым зеленым и желчным агаром с фиолетовым красным (Akbulut N. et al., 1994).
Широкое применение в качестве индикатора дифференциально-диагностических сред Гисса и ЦДС для идентификации чумного и псевдотуберкулезного микробов нашел фуксин кислый. Яромюк Г. А. и соавт. (1990) подробно описывают виды фу-ксинов, производимых отечественной промышленностью и степень пригодности их в бактериологических исследованиях.
Для дифференциации энтеробактерий Балаклеец В. С. и соавт. (1987, 1991) предлагают среды, где в качестве индикатора и селективного агента используются нейтральный красный, феноловый красный и бриллиантовый зеленый. Соколова К. Я. и соавт. (1992) применяют для этой цели среду с бромтимоловым синим.
Veronika L. (1985) отмечает высокую селективность, в сравнении со средами Эндо и VRBL, бролациновой среды, содержащей бромтимоловый синий при идентификации колиподобных бактерий.
Литинским Ю. И. и соавт. (1976) для выделения сальмонелл из испражнений методом «подвижного роста» предложены среды в состав которых входили бромтимоловый синий и крезоло-вый красный.
Из селективных сред наилучшим ростом сальмонелл и стабильностью, по данным Schomburg I. (1983), отличался агар с бриллиантовым зеленым.

28
29
Многолетние работы по выделению сальмонелл из фекалий на полужидкой среде обогащения Раппапорта (стандартная среда с 0,8% агара) показали более высокую специфичность (95,1%) и эффективность (80,3%) по сравнению с агарами МакКонки (частота выделения сальмонелл 11,1%),SS (30,2%) и с бриллиантовым зеленым (77,2%). На модифицированной среде количество выделенных сальмонелл по сравнению со стандартным методом исследования возрастало в среднем на 22,5% (Goossens H. etal., 1984).
Шиганова В. Л. (1976) для целей выделения сальмонелл и шигелл из морской воды заменила в магниевой среде накопления (Калина Г. П., Шиганова В. Л., 1972) ингибитор бриллиантовый зеленый более мягким по действию кристаллическим фиолетовым. Она зарекомендовала себя положительно при сравнении с магниевой средой, средой для выделения грамот-рицательных микробов (Graft, Miller, 1956) и средой на охмеленном сусле (рецепт НИИ общей и коммунальной гигиены им. Сеченова АМН СССР).
Результаты выделения сальмонелл из пищевых продуктов и кормов на бульоне РаппапортаВассилиадиса с малахитовым зеленым более воспроизводимы, чем на тетратионатном бульоне с бриллиантовым зеленым (среда МюллераКауффмана) и она рекомендована вместо среды МюллераКауффмана в стандартном методе ISO для выделения Salmonella.
Goetz-Grospiron E, Baron D. (1986) показали, что наилучшим из сравниваемых методов выделения сальмонелл из проб ила сточных вод является получение накопительных культур на среде МюллераКауффмана с последующим культивированием на агаре с бриллиантовым зеленым.
Humbert F. et al. (1989) после обогащения выделяли сальмонеллы из мясных продуктов на агарах с бриллиантовым зеленым и дезоксихолатном. Показана идентичность по чувствительности и специфичности субкультивирования сальмонелл на модифицированной плотной среде с бриллиантовым зеленым после селективного обогащения (Bager Е, Petersen J., 1991) методу сочетающему обогащение в бульоне РаппапортаВассилиадиса с определением специфических антигенов сальмонелл.
При выделении сальмонелл после селективного обогащения на бульоне РаппапортаВассилиадиса чувствительность агара Gassner (имеет в составе водный голубой и метахромовый желтый) составляла 91,7%, агара Kaunrnann (имеет в составе бриллиантовый зеленый и феноловый красный)86,1% (Weber A., Re-nate W, 1994).
Из использованных 5 селективных и обогатительных бульонов наилучшие результаты при выделении Sal. dublin из испражнений КРС Hoszowski A. (1989) получил на бульоне Мюллера Кауффмана, Sal. typhimuriumна селенитовом бульоне с брил-
30
лиантовым зеленым (однако хорошее выделение отмечалось и на бульоне МюллераКауффмана и на средах с малахитовым зеленым), Sal. choleraeна Vбульоне.
С целью повышения точности идентификации Sal. typhi путем предобогащения и двойного пересева, Подплетенная И. М. (1992) рекомендует дополнительно первично идентифицировать на комбинированных средах лактозоположительные, не образующие газ и сероводород культуры и пересевать их на среду, содержащую из красителей 1112 г/л 0,2%-ого водного раствора бромтимолового синего.
Олькеницкий И. С. (1958) предложил модификацию среды Крумвида, в которую входит 0,4%-ый раствор фенолового красного. Из-за невозможности исключения на ней и среде ДУКС аналогов шигелл, Калина Г. П., Трухина Г. М. (1990) разработали среды, имеющие в своем составе щелочные растворы бромтимолового синего (среда Ш-2) и фенолового красного в сочетании с водным раствором кристаллического фиолетового (среда Ш-3). В качестве основы селективных для выделения шигелл сред с антибиотиками применяют агар с эозинметиленовым синим (ЭМС).
Используемый для селективного обогащения и определения титра Е. coli бульон BGB (Brilliant Green Bile Lactose Broth) включает бриллиантовый зеленый.
Freier Т. et al. (1987) сравнивали эффективность сред m-LMM и m-TMM со стандартными средами Эндо, m-FC и PTG. В состав среды m-LMM входили, помимо других компонентов, 80 мг/л бромкрезолового пурпурного. В среду m-TMM, кроме того, перед стерилизацией вносили 0,25 мг/л Tertigol (тертигол) 7. На этих средах вырастали желтые колонии бактерий группы кишечных и фекальных кишечных палочек.
В журнале «Lab. Pract.» (1989, с. 39) рассматривается способ ускоренного выявления Е. coliиндикатора бактериальной контаминации, в образцах воды путем включения MUG (4 methyl-umbelliferyl-p-D-glucuronide) в состав трех питательных сред: желточного бульона с 2% бриллиантового зеленого, лаурилсуль-фатного бульона и бульона ЕС. С помощью данного метода Е. coli может быть выявлена в чистой или смешанной культуре через 424 ч.
Для дифференциации энтеропатогенных эшерихий предлагаются среды, содержащие кристаллических фиолетовый (Катина Г. П., 1979), конго красный (Yoder H., 1989), комбинацию фенолового красного и анилина синего.
Красильников А. П. и соавт. (1972) рекомендуют выявлять клебсиеллы на бромтимоловом агаре с лактозой и пенициллином.
Предложенная Legakis N. et al. (1976) синтетическая солевая среда, содержащая бромтимоловый синий как рН-индикатор, селективно поддерживает рост не только Kl. pneumoniae, но и
31
Serratia spp. В составе плотной среды для клебсиелл «Klebsiella 5-АСК» (Сиволодский Е. П. и соавт., 1994) также присутствует 0,060,08 г/л бромтимолового синего.
Модификации агара Эндо с использованием других красителей с ингибиторным действием для дифференциации по морфологии колоний клебсиелл были разработаны Campbell L., Roth G. (1975). В частности, ингибитором для некоторых бактерий являлся метиловый фиолетовый 2В, тогда как для клебсиелл он селективен (Campbell L. et al., 1976). Этот краситель, как показали Fung D., Miller R. (1973), в определенной концентрации ингибирует рост Е. coli, поддерживая рост Клебсиелла-Эн-теробактер-Серратиа. Мартыненко Л. Д., Солдатова Л. В. (1989) рекомендуют вводить в среду для клебсиелл 0,01% малахитового зеленого. Chein Se-Ping, Fung D. (1990) показали возможность выделения и подсчета К1. pneumoniae на желчном агаре с акрифлавином и фиолетовым красным. Наиболее оптимальной для подсчета К1. pneumoniae была концентрация акрифлавина 0,01% (исследовался диапазон от 0,01 до 0,06%). Другие микроорганизмы либо подавлялись, либо их колонии отличались от колоний Kl. pneumoniae.
Бромтимоловый синий входит в состав элективных для холерных вибрионов бромтимоловый синий-типол-агара и его отечественного аналога, предложенного Либинзоном А. Е. (1974), а также сред Попова А. Б. и соавт. (1976), Фельдмана Ю. М. и соавт. (1984), Середина В. Г. и соавт. (1990). Последняя среда ускоряет выделение и идентификацию холерного вибриона.
В полужидкую среду Ибрагимова Ф. X. и соавт. (1989, 1990) входит 2 г/л конго красного, дополняющего, отчасти, ингиби-торный эффект в отношении сопутствующих микробов. Параге-молитические вибрионы, сдвигая рН в кислую сторону, изменяют окраску конго красного в иссиня-черный цвет. Показано преимущество предложенной среды по сравнению со средой Либинзона А. Е. (1974). Хорошими накопительными свойствами обладают глюкозосолевой типоловый бульон GSTB (Joseph S. et al., 1982) и его модифицированный вариант (Bartley С, Slanets L., 1971), содержащие, в частности, метиловый фиолетовый. В качестве среды обогащения используется солевой пептонный бульон с этиловым фиолетовым (Beuchat L., 1976).
По Fung D., Miller R. (1973), изучавшим действие 42 красителей на микроорганизмы клинического происхождения (стафилококки, микрококки, энтеробактерии, эшерихии и др.), рост Ps. aeruginosa тормозил только кристаллический фиолетовый. Несколько иные данные получены Киприановой Е. А., Корнюшен-ко О. Н. (1978), определившими видовую чувствительность псевдомонад к 49 красителям. Наиболее широким антимикробным спектром обладали метиловый и кристаллический фиолетовые, метиловый зеленый; тогда как анилиновый голубой и феноловый красныйвообще не угнетали псевдомонады.
Рожавиным М. А., Бугаевой Е. И. (1986) представлен краткий, но емкий обзор литературы по использованию селективных агентов для выделения Ps. aerugenosa, в том числе бриллиантового зеленого (Жарикова М. С. и соавт., 1983), кристаллического фиолетового (Mossel D. et al., 1976) и кристаллического фиолетового в сочетании с нейтральным красным (Daly J. et al., 1984).
Поданным Schubert R., Blum H. (1974) малахитовый зеленый в концентрации 1:100000, не тормозя рост Ps. aeruginosa, задерживает рост большинства видов других псевдомонад, что послужило основанием для включения среды с этим ингибитором в нормативный документ ФРГ DIN (Deutsche Institut fur Normung 3841, часть 5, Эрфурт, 1981). Однако в обстоятельной работе Geuenich H., Muller S. (1982) показана низкая результативность среды с малахитовым зеленым по прописи DIN в сравнении с другими средами. Подвергаются сомнению (Калина Г. П., Ком-золова Н. Б., 1988) ингибирующие свойства и бриллиантового зеленого, отмечавшиеся Lowburry Е. (1951), Gould J., McLeod J. (1960). Этот краситель входит в состав бульона с мертиолатом, применяемого в исследовании испражнений (Lowburry E. (1951) и селенитовой средыиспользуемой при анализе воды (Neme-di L., Lanyi В., 1970). В нашей стране он включен в накопительный бульон для одноступенчатого выделения Ps. aeruginosa (Кол-кер И. И. и соавт., 1977). Для выявления данного микроорганизма Schubert R. (1989) предложил среду ABGP, включающую крезоло-вый красный, бромтимоловый синий и бриллиантовый зеленый. В частности, бриллиантовый зеленый в использованной концентрации подавляет рост грамположительных микроорганизмов, но не токсичен для Ps. aeruginosa.
Еще в 1948 году Miller W. et al. рекомендовали для подавления других видов микроорганизмов при изоляции возбудителя ме-лиоидоза применять кристаллический фиолетовый (1:200000), профлавин, акрифлавин, акридины оранжевый и желтый (1:500000), фуксин основной или кислый (1:100000), малахитовый или бриллиантовый зеленый (1:1000000). Эти красители для аналогичных целей используются и при изоляции возбудителя сапа, хотя в определенной степени задерживают и без того недостаточный рост последнего. Жога Л. К. и соавт. (1995) при конструировании транспортной среды для патогенных псевдомонад в качестве ингибиторов сопутствующей микрофлоры использовали красители, не влиявшие на возбудителей сапа и мелиоидоза, устойчивых, например, к генциановому фиолетовому.
Феноловый красный содержится в FC-arape для культивирования Bord. bronchiseptica (Vidic В. et al., 1993).
Калфин Е. X. (1962) включил для диагностики туберкулеза в среду Безредки ряд дополнительных ингредиентов. Малахитовый зеленый при этом снижал загрязнение среды банальной микрофлорой. Между тем, Stottmeier D. (1962) отмечает невозможность отличить атипичные и сапрофитные микобактерии между

32
2 3-235
33
собой и от М. avium посредством питательных сред с феноловым красным или при сочетании фенолового красного с малахито вым зеленым. „„ '
Мордовской Г. Г., Ступина Н. М. (1975) изучили эффект ряда красителей на характер и сроки роста микобактерий туберкулеза на среде «Новая». Влияние пищевых красителей и нигренола в концентрациях 80 мг/мл отсутствовало. Конго красный обладал наименьшим туберкулостатическим действием (40 мг/мл), бриллиантовый зеленый почти в 20 раз (2 мг/мл), малахитовый зеленыйв 40 раз и генциановый фиолетовыйв 200 раз более эффективнее, а метиленовый синий полностью задерживает рост микобактерий туберкулеза при данных концентрациях. Малахитовый зеленый в оптимальных концентрациях (0,30,6 мг/мл) не задерживает рост микобактерий, но угнетает стафилококки, на которые не влияют пищевые красители и нигренол. Бриллиантовый зеленый задерживает рост стафилококка только при концентрациях в 10 раз превышающих оптимальные величины, не действующие на рост микобактерий туберкулеза. Таким образом, не найдено эквивалентных заменителей малахитового зеленого Между тем, имеются данные (Muller G., Galisti G ) о рост-стимулирующем эффекте бриллиантового зеленого на М. tuberculosis, вследствие чего этот краситель используется в среде ПГ-30 (Ковалев Г. К., Александров Н. А., 1969).
Ковалев Г. К. (1982, 1988) сравнил дифференцирующую ценность для М. bovis и М. tuberculosis сред ВагенераМичерлиха (Wagener К., Mitscherlich E., 1951) с бромкрезоловымпурпурным; Альтерфогта-Кукхерма (Altevogt R., Kuckherm В., 1955) содержащей комбинированный индикатор; Лебека (Lebek G 1958) с добавлением бромтимолового синего по Schmiedel A. (1960); и Нассаля (Stottmeier D., 1962). Для последней основой являлась среда II Петраньяни с введением фенолового красного или комбинированного индикатора из фенолового красного с малахитовым зеленым. Принцип действия всех перечисленных сред основан на свойстве М. tuberculosis ферментировать глицерин с образованием кислоты, а М. bovis, напротив, сдвигает рН в щелочную сторону. Сдвиг рН среды улавливается индикатором, в качестве которого и используются те или иные красители. Однако развитие резистентности к туберкулостатикам приводит к ряду необратимых нарушений процессов метаболизма у микобактерий, в частности кислотообразования при расщеплении глицерина, и среды не срабатывают (Meissner G., 1961). В то же время, У некоторых растущих эйгонических вирулентных для кроликов М. bovis, напротив, рН смещается в кислую сторону.
Микобактерий очень устойчивы к трифенилметановым красителям (кристаллический фиолетовый, основной фуксин, бриллиантовый и малахитовый зеленые), поэтому малахитовый зеленый часто включают в среды для выделения М. tuberculosis в целях подавления роста других бактерий. Его содержание в про-
писях питательных сред, рекомендуемых разными авторами (табл. 1) колеблется в широких пределахот 0,0001 до 0,12%. Не задерживая полностью рост плесневых грибов, малахитовый зеленый, в то же время, абсолютно угнетает рост М. tuberculosis и М. bovis при дозе 0,09% (Тимченко 3. К., 1985).
Таблица 1.
Содержание малахитового зеленого в средах для выделения М. tuberculosis (по Тимченко 3. К., 1985 с дополнениями)


Питательная среда
Кол-во малахитового зеленого, %


Биотин-каталазная
0,0001


Шула (Sula)
0,0005


Лангенштейдта
0,00105


Middlebrook7H10H7Hll
0,0025


Калфина Е. X. Мельник Е. Т., Плоскирева Н. В.
0,02


Финна-2
0,02


Огавы (Ogawa)
0,02


среда № 10 (Коваля Н. Н., 1977)
0,02


Гельберга С. И.
0,025


Левенштейна- Йенсена
0,03


Лаанес-Тайместер
0,03


Смолянского А. 3.
0,03


среда ATS
0,036


Зимина А. Е.
0,05


Петраньяни
0,05


Стоунбрика (Stonebrink)
0,07


Розенблат В. М.
0,08


Аникина В. А. и др., 1982 (брил, зел.)
0,01-0,1


Рр1тястпяп1
0,12


-Г CLldglldlil
Коваль Н. Н., 1980; Самилло Г. К, 1988



По данным Lior H., Patel A. (1987) на модифицированной среде с толуидиновым синим ДНК-азная активность обнаруживалась у большего, чем на агаре с метиленовым зеленым (Appl. Microbiol., 1969, v. 18, p. 991993) количества штаммов кампило-бактерий (С. pylori, С. jejuni, С. coli, С. laridis). А у С. pylori ДНК-азная активность вообще выявлялась только при использовании первой среды.
Ставский А. В., Червонная Н. И. (1992) с целью повышения селективных свойств, упрощения и ускорения выделения патогенных стафилококков дополнительно вводили в среду также 3 3,5 мл 0,1 %-ого водного раствора кристаллического фиолетового на 1 л среды. Van Enk R., Thompson К. (1992) разработали для выделения метициллинустойчивых St. aureus модифицированную

34
2*
35
селективно-дифференциальную среду, содержащую феноловый красный. Из 30 видов бактерий и 5 видов грибов на ней росли лишь метициллинустойчивые St. aureus, St. xylosus, Candida tropi-calis и Proteus mirabilis.
Для индикации патогенных стрептококков в молоке и молочных продуктах используют среду ТКТ, имеющую в своем составе кристаллический фиолетовый. Для выделения агалактииных стрептококков предлагаются селективные среды с кристаллическим фиолетовым (Edwards, 1933), а гноеродных стрептококковс генциановым фиолетовым (Garrad G., 1933).
Среда SMA, предназначенная для выращивания всех видов вызывающих мастит стрептококков и позволяющая дифференцировать Str. faecalis и непатогенные стрептококки, содержит в своем составе кристаллический фиолетовый, бромкрезоловый пурпурный и бромкрезоловый зеленый (Wilson J., Jeffrey D., 1987).
При конструировании элективной среды для выделения патогенных стрептококков Дзюбак А. П. (1993) использовал генци-ановый фиолетовый.
Осокина Т. И., Алиева Р. О. (1986) показали неэффективность, в сравнении с 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом, использования в качестве редоксиндикаторов метиленового синего, фенолового красного и нейтрального красного в среде для определения чувствительности пневмококков к антибиотикам.
Шеломинская Т. Д., Балаклеец В. С. (1991) использовали в среде для выделения энтерококков как селективный агент кристаллический фиолетовый.
Гаджиева Г. Р. и соавт. (1989) предлагают оригинальную среду для выделения U. urealyticum с использованием бромкрезолово-го пурпурового. Хилькевич Н. Д. (1991) высевал U. urealyticum на жидкую среду с индикатором бромтимоловым синим (окраска изменяется с желтой на зеленую в течение 24 ч). 67% колоний данного микроорганизма росли на плотной среде, т. е. имели место 33% ложноположительных результатов.
Башмакова М. А., Солдатова В. М. (1969, 1971) показали пригодность для выделения микоплазм из полового тракта женщин жидких дифференциально-диагностических сред, содержащих как индикатор 0,002% раствор фенолового красного и один из компонентов, по разложению которого проводили индикацию роста микоплазм. Плотные варианты не годились, т. к. ожидаемого изменения цвета среды вокруг колоний микоплазм не было. Феноловый красный в качестве индикатора присутствует также в среде Escarquel С, Grosso M.-H. (1989), позволяющей высо-коспецифически выращивать микоплазмы, значимые в человеческой патологии, и среде Маврова И. И. и соавт. (1992) для выделения уреаплазм.
Praznik J. (1969) рекомендует использовать при выделении М. pneumoniae из дыхательных путей и мочеполового тракта агар
с метиленовым синим по Крейбиллу. Antal V. et al. (1988) выделили от лошадей ахолеплазмы, которые ферментировали глюкозу, редуцировали тетразол и метиленовый синий, адсорбировали эритроциты и не расщепляли аргинин.
Goldschmidt M. et al. (1991) показали пригодность неингиби-рующей среды (YM-arapa), содержащей 0,01% анилинового голубого красителя W6, цветной индекс 42780 (YMAB), для ускоренного выделения и идентификации С. albicans среди изученных 1554 шт. дрожжей.
Ряпис И. В., Янушкина О. С. (1991) предложили селективную среду для определения принадлежности исследуемых дрожжей к виду С. maltosa, включающую для повышения специфичности, упрощения и ускорения исследования, дополнительно родамин 6Ж и акрифлавин.
Bragulat M. et al. (1995) исследовали влияние ряда красителей на эффективность подсчета колоний грибов в чистых и смешанных культурах. Используя солодовый экстрактный агар как ос-новую и контрольную среду, были испытаны следующие концентрации красителей: 0,000025 аурамина, 0,000005 генцианового фиолетового и 0,000001 малахитового зеленого. Наибольшая численность обычно отмечалась в среде с дихлораном, бенгальским розовым (рекомендуемые ингибиторы распространения плесени) или аурамином. Малахитовый зеленый использовался в основном как жесткий ингибитор распространенных плесеней, позволяющий только адекватное развитие и восстановление тестируемых штаммов Fusarium и Aspergillus.
Jones L., Brinley M. (1958) показали, что среды с бактериоста-тическими красителями являются ингибиторными для Br. abortus биотип 2 и других привередливых штаммов. Использование вместо красителей антибиотиков давало возможность расти всем биотипам видов бруцелл, выявляемых на селективных средах. По данным Пинигина А. Ф. и соавт. (1979) бруцеллы, выделенные от северных оленей, растут на питательных средах в присутствии основного фуксина, тионина; метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый и пиронин Б их рост подавляют. Тарасова Т. А. и соавт. (1983) получали гладкий вариант Br. ovis пассажем на средах с анилиновыми красителями. Модифицированная Barrow G., Peel M. (1987) селективная среда Mair N. (1955) содержит, помимо антибиотиков, генциановый фиолетовый. Неспособность некоторых штаммов Br. abortus расти на ней подтверждает их чувствительность к очень низким концентрациям красителя, признаваемую Mair N. (1955).
Окрашивание колоний L. pneumophila бромкрезоловым пурпурным и бромтимоловым фиолетовым в среде Wadowsky R, Yee R. (1981) улучшает их идентификацию (Renner E., Tseng С,
Szynkiewicz Z., Binek M. (1986), оценивая селективные среды Для первичного выделения Т. hyodysenteriae и Т. innocens, опреде-

36
37
лили оптимальные концентрации наиболее эффективных ингибиторов, в том числе и бриллиантового зеленого.
По данным Mishra S. et al. (1987) из селективных сред для первичного выделения Aeromonas spp. из фекалий животных содержащая бриллиантовый зеленый и соли желчных кислот оказалась наименее эффективной. Хотя наилучшей, в том числе по чувствительности, оказалась среда, содержащая 30 мг/л ампициллина, для улавливания ампициллинчувствительных штаммов Aeromonas и негемолитических A. caviae, авторы рекомендуют использовать комбинацию среды с ампициллином и среды, содержащей ДНК-азу, толуидин голубой и ампициллин 10 мг/л.
Для подсчета мезофильных видов клостридий Weenk G. et al. (1995) использовали агаровую среду с бромкрезоловым фиолетовым.
Антибиотики
Селективные среды с антибиотиками для выделения ши-гелл в нашей стране разработаны Черномордиком А. Б. (1957). В качестве их основ применяют обычные коммерческие среды Плоскирева, ЭМС, Эндо с добавлением антибиотика, при выборе которого учитывают антибиотикограммы выделяемых в данной местности штаммов шигелл (тетрациклин, стрептомицин, левомицетину нас в стране и новобиоцин, ампициллин и др.за рубежом, например в среде МакКонки). Ценность сред с антибиотиками теснейшим образом связана с контролем спектра антибиотикоустойчивости шигелл. В условиях меняющейся тактики применения антибиотиков в терапии дизентерии, ветеринарной практике и т. д. штаммы шигелл могут не только приобретать новые, но и утрачивать прежние маркеры устойчивости. Последнее следует иметь в виду при конструировании сред с антибиотиками (Прямухина Н. С. и соавт., 1980).
По данным Cummings M. et al. (1987), сравнивавшего 3 жидкие среды, добавление пенициллина, полимиксина В, амфоте-рицина В и эритромицина положительно сказывается на выделении М. hominis.
По Jorgensen J. et al. (1987) и Barry A. et al. (1988) определение чувствительности Н. influenzae к антибиотикам на среде НТМ сопоставимо, или даже эффективнее (для ампициллина, аугментина, бисептола, эритромицина и кларитромици-на), чем на других жидких и плотных средах, включая бульон Мюллера-Хинтона и шоколадный агар, рекомендованных Национальным Комитетом по стандартам в клинической микробиологии для этих целей. Особенно важно, что на среде НТМ возможно правильное определение чувствительности к три-
метоприм/сульфометоксазолу. Dabernat H. et al. (1993) определяли на этой среде чувствительность Н. influenzae к р-лакта-мам.
В качестве селективной при исследовании загрязненных проб используется среда с неомицином, фурацилином и фураги-ном (Шипицын А. Н., Слинько В. Г., 1979).
Adler В. et al. (1986) предлагают для выделения лептоспир из клинического материала, контаминированного посторонней микрофлорой, полужидкую твин-альбуминдвую среду EMJH, в состав которой включены актидион, бацитрацин, 5-фторурацил, неомицина сульфат, полимиксин В и рифампицин.
Szynkiewicz Z., Binek M. (1986) определили оптимальные концентрации наиболее эффективных ингибиторов (спектино-мицина и ванкомицина) в селективных средах для первичного выделения Т. hyodysenteriae и Т. innocens.
По данным Kunkle R. et al. (1988) концентрация микробных клеток Т. hyodysenteriae, выращенных на триптиказо-соевом агаре с добавлением спектиномицина; колистина и ванкомицина; либо спирамицина, рифампицина, ванкомицина, колистина и спектиномицина была идентичной.
Комплекс антибиотиков используется в плотных селективных средах для выделения кампилобактерий из фекалий людей и внутренних органов животных и птиц.
Голиков А. В., Зенин И. В. (1980) предлагают среду ПСТК для выделения термофильных кампилобактерий (С. jejuni и С. coli) из фекалий, селективными компонентами которой являются рифампицин, подавляющий рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов; полимиксин М, активный в отношении грамотрицательных микроорганизмов, и противогрибковый препарат нистатин. Перечисленные препараты не подавляют рост термофильных кампилобактерий (MIC более 100 мкг).
Bolton F. et al. (1988) исследовали эффективность для выделения из фекалий кампилобактерий следующих селективных агаров: Skirrow, Preston, Fennell и модифицированный агар ССД. Самой селективной оказалась среда Fennell. На основании полученных результатов для выделения Campylobacter рекомендуется модифицированный агар ССД с амфотерицином.
Для подавления сопутствующей микрофлоры наиболее популярна комбинация селективных агентов по Скирроу (Skirrow): 10 мг/л ванкомицина, 2500 МЕ/л полимиксина В, 5 мг/л триме-топрима (Рожавин М. А., Струк В. М., 1989; Krajden S. et al, 1987; Coudron P., Kirby D., 1989). В связи с тем, что полимиксин В нередко угнетает рост С. pylori, он был заменен цефсулодином. а для подавления роста грибов добавлен амфотерицин В, что существенно повысило эффективность среды (Dent J., McNalty С, 1988). Кроме того, к средам добавляют цефалексин, налидиксо-вую кислоту, бисептол, рифампицин, полимиксин М и др. как по

38
39
отдельности, так и в различных сочетаниях (Чайка Н. А. и соавт., 1988; Иванов В. П. и соавт., 1991; Patton С. et al., 1981; Bolton F. et al., 1984; Goodwin С et al., 1985; Rinkard K. et al., 1986; Barbosa A. et al., 1988; Parsonnet J. et al., 1988).
Queiroz D. et al. (1987) разработали индикаторную среду для С. pylori на основе сердечно-мозгового агара с добавлением ван-комицина, налидиксовой кислоты, амфотерицина В.
Lambert Т. et al. (1986) установили наибольшую ингибирую-щую активность С. pylori у пенициллина, ампициллина, амокси-циллина, цефотаксима, тобрамицина, гентамицина и тетрациклина; несколько меньшаяу цефалотина, канамицина и эритромицина. Все штаммы были резистентны к ванкомицину, но многие культуры были достаточно чувствительны к колистину и налидиксовой кислоте. Значительная резистентность С. pylori отмечалась к цефсулодину.
Riedel В. et al. (1987) для выделения термофильных кампило-бактерий использовали агар Колумбия с селективными добавками, ингибирующими рост контаминантных бактерий (10 мг/л ванкомицина, 2,5 МЕ/л полимиксина В, 15 мг/л цефалотина и 2 мг/л амфотерицина В). Выделенные штаммы С. jejuni обладали высокой чувствительностью к доксициклину, неомицину, эритромицину, фуразолидону и амоксициклину. Некоторые культуры были устойчивы к хлорамфениколу и абсолютно все штаммы С. jejuniрезистентны к сульфаметоксидиазину.
Известно, что возбудители сапа и миелоидоза чувствительны к тетрациклину, новобиоцину, канамицину, хлорамфениколу, тогда как антибиотикограммы Ps. fluorescens и Ps. putida носят иной характерони чувствительны к полимиксину и антибиотикам-аминогликозидам (Von Graevenitz A., 1985). Более подробно видовая чувствительность псевдомонад к различным антибиотикам рассмотрена в монографии Смирнова В. В., Киприанова Е. А. (1990).
Рассмотрим вкратце отдельные антибиотики, наиболее часто используемые в микробиологических средах.
Препараты нитрофуранового ряда (производные 5-нитрофу-рана)фурациллин, фурагин, фурадонин. Zacharian P., Listen J. (1973) установили отсутствие влияния фурагина на рост Ps. aeruginosa при угнетении развития других микроорганизмов. Используется фурагин в сочетании с фурапилином в средах для выделения лептоспир (Шипицын А. Н., Слинько В. Г, 1979) и Ps. aeruginosa (Ароне Р. М., Чурсина Т. В., 1975, 1976). Кроме того, для выделения Ps. aeruginosa применяются фурациллин с фу-радонином (Mossel D. et al., 1976; Negretti E, Trabattoni C, 1984). Фурадонин в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры входит в состав селективной среды для выделения кишечных иерсиний (Бондаренок В. М. и соавт., 1983).
Пенициллин рекомендуется вводить в среды для подавления сопутствующих видов микроорганизмов при выделении псевдо-
40
монад, в частности возбудителя мелиоидоза (Miller W. et al., 1948), Ps. aeruginosa (Sands D., Rovira A, 1970; Тыдельская И. Л. и соавт., 1980). Недостатком этого антибиотика является невозможность длительного (более 2 нед) хранения готового состава сред в холодильнике из-за инактивации (Рожавин М. А., Бугаева Е. А., 1986). Калина Е П., Комзолова Н. Б. (1988) рекомендуют для накопления Ps. aeruginosa заменить в среде Bonde пенициллин на кристаллический фиолетовый как более мягкий ингибиторэффективность этой модифицированной среды проверена на большом материале и признана официально. Ps. mallei достаточно чувствительны к пенициллину, который, наряду с посторонней микрофлорой, тормозит и их рост. Важно отметить что бензилпенициллин является питательным субстратом для патогенного микроорганизма Ps. cepacia, вызывающего более тяжелые осложнения и больший процент летальных исходов, чем Ps. aeruginosa (Prince A., 1986).
Устойчивость микоплазм к пенициллину позволяет использовать его в качестве селективного агента. Cummings M. et al. (1987) показали увеличение выделяемое™ М. hominis при добавлении в среду культивирования 500 ЕД/мл пенициллина. Жевер-жеева И. В. и соавт. (1983) добавляли в среду 1000 ЕД/мл пенициллина. Однако некоторые виды (М. neurolyticum, M. hyopneu-moniae, M. floculare) более чувствительны к нему. Raddi M. et al.
(1992) рекомендуют культивировать уреаплазмы, в частности U. urealyticum, в клинических лабораториях на среде U-9, в со став которой входит пенициллин.
Среда G20G, содержащая пенициллин (Smith I., Baskerville A., 1979), и агар МакКонки, куда дополнительно вводят пенициллин и нитрофурантин (Elias В., Galgoczi В., 1981), используются для изоляции Bord. bronchiseptica (Smith I., Baskerville A., 1979). Наиболее эффективно добавление в питательную среду комбинации пенициллина с фуралтадоном (Hommez J. et al., 1984). Vidic В. et al.
(1993) на различных плотных средах исследовали чувствитель ность Bord. bronchiseptica к ряду антибиотиков. Наилучшие ре зультаты получены при использовании кровяного и FCагаров, содержащих пенициллин в сочетании с цепорексом или с нитро- фурантином (68-69,4%).
Пенициллин используется в среде для выделения возбудителя туляремии из материалов обильно обсемененных другими микробами (Кундин В. А., 1969). Однако эта среда слабочувствительна и имеет низкие ростовые свойства (Сухарь В. В. и соавт., 1989).
В состав полужидкой среды Погореловой Н. П. (1984) для J- enterocolitica помимо других компонетов вводятся 20 ЕД/мл пенициллина в сочетании с полимиксином.
Отмечается чувствительность к бензилпенициллину 95,4% штаммов цитробактеров, выделенных из фекалий людей и из внешней среды (Садыкова М. Ш. и соавт., 1986).
41
Красильников А. П. и соавт. (1972) предложили специальный бромтимоловый агар с пенициллином для диагностики склеромы и озены (клебсиеллы).
В средах Campbell L., Roth G. (1975) ингибитором ряда бактерий является пенициллин, тогда как для группы Клебсиелла-Энтеробактер-Серратиа он селективен.
Lambert Т. et al. (1986) установили высокую ингибирующую активность пенициллина применительно к С. pylori.
Пенициллин входит в состав селективной среды VPBC для парагемолитических вибрионов, где подавляет, по оценке Ushiji-ma Т. et al. (1985), рост большинства энтеробактерий, стафилококков, клостридий, бифидумбактерий и некоторых других.
Неустроева В. В. и соавт. (1983) культивировали L-формы стрептококка на среде с 1000 ЕД/мл пенициллина. Отмечается L-трансформации микобактериальных клеток под воздействием пенициллина (Шим Н. В. и соавт., 1989).
Бойков Ю. И. (1968) рекомендует дифференцировать В. ап-thracis по росту на МПА с пенициллином. Отмечается L-транс-формация микобактериальных клеток под воздействием пенициллина (Шим Н. В. и соавт., 1989).
Карбенициллин. Evans M. et al. (1986) продемонстрировали слабую вариабельность чувствительности Ps. aeruginosa к нему в 10 видах жидких сред, главным образом являющихся модификациями бульона Мюллера-Хинтона.
Бондаренок В. М. и соавт. (1983) в селективной среде для выделения кишечных иерсиний в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры использовали, в частности, карбенициллин.
По данным Садыкова М. Ш. и соавт. (1986) 59,4% штаммов цитробактеров, выделенных из фекалий людей и из внешней среды, чувствительны к этому антибиотику.
Thorn В. (1970), Davis Т., Matsen J. (1974), Bagley S., Seidler R. (1978) выделяли клебсиеллы из фекалий на селективной среде с основой из агара МакКонки со 100 мг/мл и менее карбеницилли-на, в связи с высокой резистентностью к нему данных микроорганизмов. Распознавание на этой среде клебсиелл было лучше, чем на агаре Эндо. Тем не менее, позже Tomas J. et al. (1986) заменили карбенициллин теллуритом калия. Показано некоторое преимущество последней среды и, кроме того, она пригодна к употреблению в течение 10 нед при 4°С. Однако интерес исследователей к карбенициллину не остыл (Пахил С. И., 1992). Пого-релова Н. П. (1995) сконструировала простую высокочувствительную и селективную среду для выделения Kl. pneumoniae, основанную на нитрат-сахарозной среде ИСК и включающую 10 мкг/мл карбенициллина.
Holm A. et al. (1987) сообщают о модификации агара из триптического перевара сои с рядом компонентов, в том числе и карбенициллиномсреда Н для выделения Н. aphrophilus бактерий при различных заболеваниях полости рта. При этом
массивная контаминация посевов на средах снизился с 52 до 2%, а количество колоний Haemophilus даже увеличивалось. По сравнению с кровяным агаром рост Haemophilus на этой среде угнетался не более, чем в 10 раз, в то время как рост сопутствующей микрофлоры (6 шт. Capnocytophaga и Neisseria)в 1000 1000 000 раз.
Mitchison D. et al. (1972, 1973) усовершенствовали селективную агаровую среду 7Н10 для микобактерий добавив комплекс антибиотиков, включающий и 100 мкг/мл карбенициллина (PACT). В дальнейшем McClatchy et al. (1976) уменьшили концентрацию последнего в этой среде до 50 мкг/мл. В связи с инги-бирующим действием на рост микобактерий, а также со слабым влиянием на рост псевдомонад среды PACT, разработана смесь PANTA, где карбенициллин заменен другими антибиотиками. Продемонстрированы существенные преимущества PANTA по сравнению с PACT (Tice L., Roberts G., 1986; Siddigi S., Hwang-bo C, 1986; Libonati J. et al., 1986), в частности снижение количества проростов до 2% при той же длительности выявления микобактерий.
Полимиксины В и М подавляют грамотрицательную микрофлору. Учитывая малую чувствительность возбудителя мелиои-доза к полимиксину Ширяев Д. Т. и соавт. (1976) рекомендуют добавлять его в среды для исследования проб.
Полимиксин В вместе с бацитрапином входят в состав среды OFPBL для выделения Ps. cepacia (Welch D. et al., 1987).
Жога Л. К. и соавт. (1995) в транспортной среде для патогенных псевдомонад в качестве ингибиторов сопутствующей микрофлоры использовали, в том числе, 0.0025 г/л полимиксина. Возбудитель сапа относительно устойчив к полимиксину (MIC 1000 мкг/мл), который применяется в соответствующих средах для подавления посторонней микрофлоры. Тем не менее, при прямом посеве он задерживает рост и Ps. mallei.
По данным Cumrnings M. et al. (1987) добавление полимиксина В в комплексе с другими антибиотиками повышало эффективность выделения М. hominis на среде SP-4.
Этот антибиотик входит в состав полужидкой твин-альбуми-новой среды EMJH для выделения лептоспир из клинического материала, контаминированного посторонней микрофлорой (AdlerB. etal., 1986).
В различных сочетаниях с другими антибиотиками он содержится в среде для гонококков Thayer J., Martin J. (1964) и ее модификации (Кунцевич Л. Д. и соавт., 1975; Alessi E. et al, 1982 и др.). Недостатком указанных сред является чувствительность части гонококков к данным антибиотикам, вследствие чего определенный процент заболеваний гонорейной инфекцией не подтверждается бактериологически. Ухудшает культуральную диагностику гонореи также нестабильное подавление перечисленными средами сплошного роста сопутствующей микрофлоры

42
45
в связи с повышением антибиотикорезистентности нормально вегетирующей на слизистых микрофлоры вследствие широкого, не всегда контролируемого применения антибиотиков и формирования перекрестных антибиотикоустойчивых штаммов бактерий. Известное множество других сред с селективными добавками (Berger U., 1966; Granato P. et al., 1980; Mirret S. et al., 1981 и др.) в какой-то степени отражает необходимость создания улучшенной селективной среды для изоляции и роста гонококков. Полимиксин входит также в состав сред для выделения гонококков Овчинникова Н. М., Яцухи М. В. (1970), Гаджиевой Г. Р. и со-авт. (1989), Evans G. et al. (1989).
Полимиксин содержат высокоселективная среда Farrell I., Robinson L. (1972) для бруцелл, среда Wadowsky R., Yee R. (1981) для изоляции L. pneumophila, элективная среда для культивирования листерий (Метод, рекомендации ..., 1987).
Предварительный посев используемого материала в солевой бульон с полимиксином В позволяет повысить специфичность TCSB-arapa, широко используемого для выделения вибрионов. В связи с неадекватностью имеющихся сред для выделения патогенных вибрионов, Massad G., Oliver J. (1987) разработали высокоизбирательный в отношении V. cholerae и V. vulnificus CPC-агар, также содержащий полимиксин В.
Полимиксины М и В входят в комбинацию антибиотиков по Skirrow М. (1977), а также в состав среды ПСТК (Голиков А. В., Зенин И. В., 1980), используемых для выделения кампилобактерий. Schulze F. et al. (1987) выделяли и дифференцировали кампилобактерии на агаре Мюллера-Хинтона с комплексом антибиотиков, включающим 5000 МЕ/л полимиксина В. Колтс К. К. и соавт. (1990) при выделении С. pylori из биоптатов слизистой желудка добавляли в среду 40 000 ЕД/л полимиксина М. Cellini L. et al. (1992) предложили для выращивания и определения уреазной активности у С. pylori модификацию агара Колумбия, где селективность достигалась добавлением антибиотиков, в том числе полимиксина В. Campylobacter-селективный комплекс фирмы «Oxoid», добавляемый в среды для выделения С. jejuni, содержит 5 антибиотиков, в том числе 92 500 МЕ/л полимиксина В. Для выделения кампилобактерий Chan Е, Mackenzie А. (1986), Gericke В., Reiss-rodt R. (1986), Riedel B. et al. (1987), Сотирова П., Александрова Ст. (1989) использовали среды с селективными добавками, включающими полимиксин.
Полимиксин входит в состав желчно-цитратной и щелочно-полимиксиновой сред для количественного учета энтерококков (Рекомендации..., 1972) и молочной среды для идентификации энтерококков (Калина Г. П., 1973).
При выделении В. cereus рекомендуется посев осуществлять в солевом полимиксиновом агаре Пивоварова Ю. П. (1970) и среде ЖАМПФ (желточный агар с маннитом, полимиксином и феноло-
вым красным). В сравнении с традиционной средой Mossel (MYP) для изоляции, идентификации и предварительного подсчета В. cereus и соответствующих видов В. thuringiensis, альтернативная селективно/индикаторная культуральная среда VRM (Devascon-cellos E, Rabinovitch L., 1995) не требует наличия антибиотиков, таких как полимиксин В. При этом В. megaterium в ней ингибиру-ется.
Полимиксин содержат модифицированный агар Яро-щук В. А. и соавт. (1985)для выделения, и среды Ставропольского НИИВСдля обнаружения и лабораторной диагностики сибиреязвенного микроба (Метод, указания ..., 1986). Высокой чувствительностью, по данным Тартаковского И. С. и соавт. (1983), Airlie W. (1987), обладает буферный угольно-дрожжевой агар с полимиксином. Входит этот антибиотик и в состав полужидкой среды Погореловой Н. П. (1984).
Дрожжеподобные и грибы рода Candida рекомендуется выделять на среде Сабуро с 200 мг/мл полимиксина (Грачева Н. М. и соавт., 1986).
Mitchison D. et al. (1972, 1973) усовершенствовали селективную для микобактерий агаровую среду 7Н10 добавив в нее 4 антибактериальных агента, в том числе 200 ЕД/мл полимиксина В. Он представлен в составе антимикробных смесей Mitchison (PACT) и PANTA, применяемых в средах для выявления микобактерий. Последняя используется в комбинации со средами Bactec 12Аи7Н12.
Thomas С. et al. (1989) показали ингибирование роста М. avi-um-intracellulare, M. xenopi, M. kansasi и М. fortuitum на различных нерадиоактивных жидких средах (Bactec 6A, сердечно-мозговой бульон, среда Дюбо и некоторые модификации среды Кирхнера) при добавлении антибиотиков пиперапиллина, ам-фотерицина В, полимиксина В.
Для выделения CI. perfringens и его количественного определения рекомендуется применение среды СПН (сульфит-поли-миксин-неомициновая среда) (Метод, письмо ..., 1971).
Изящный вариант методики подсчета спор мезофильных видов клостридий в сухих продуктах предлагают Weenk G. et al. (1995), использовавшие сочетание дифференциального клостри-диального (DCA) и маннитол-яичный желток-полимиксин-бромкрезоловый фиолетовый-агаров.
Eisgruber H., Reuter G. (1995) отмечают селективность, суль-фитредуцирующую способность и ростовые свойства для клостридий сульфит-полимиксин-сульфадиазинового (SPS) и олеан-домицин-полимиксин-сульфадиазин-перфрингенс-селективно-го (OPSP) агаров.
Элективная среда Дзюбак А. П. (1993) для выделения патогенных стрептококков содержит 5001000 ЕД/мл полимиксина.
Van Enk R., Thompson К. (1992) предложили для выделения метициллинустойчивых St. aureus модифицированную селектив-

44
45
но-дифференциальную плотную среду с 10 мг/л полимиксина В. На ней росли также метициллинустойчивые St. xylosus (дифференцируют пробой на коагулазу), а также Candida tropicalis и Proteus mirabilis (не ферментируют, в отличие от St. aureus, маннит). Для выделения стафилококков из пищевых продуктов используется и теллурит-полимиксин-желточный агар (Varadaraj M., Ran-ganathanB., 1985).
Стрептомицин. Учитывая малую чувствительность возбудителя мелиоидоза к стрептомицину Ширяев Д. Т. и соавт. (1976) рекомендуют при исследовании проб добавлять в среду 50 мкг/мл его. Такие количества, подавляя рост большинства видов посторонней микрофлоры не угнетали рост музейных штаммов возбудителя мелиоидоза.
В известную среду ADM для дифференциации Aspergillus позднее был введен стрептомицин (Hocking A., Pitt J., 1986). Shipton W, Zahari P. (1987) для выделения возбудителя базидио-боломикоза из патологического материала предварительно обрабатывали его раствором пенициллина (20 МЕ/мл) и стрептомицина (40 мкг/мл).
В зависимости от антибиотикограммы штаммов, стрептомицин может входить в состав селективных сред для выделения ши-гелл (Черномордик А. Б., 1957).
Klink E., Smulder E (1990) выделили из печени, почек и мышц откормленных телят серотип Sal. dublin чувствительный, в частности, к стрептомицину.
Тщательно исследовали чувствительность М. bovis БЦЖ к стрептомицину Rousseaum P., Dupuis M. (1990).
Амфотерицин В. Cummings M. et al. (1987) отмечают эффективность добавления комбинации антибиотиков, включающей амфотерицин, в среды для выделения М. hominis.
Этот антибиотик присутствует в среде Evans G. et al. (1989) для изоляции и роста гонококков.
Амфотерицин В входит в комплекс антибиотиков, используемых в плотных селективных средах для выделения кампилобак терий из фекалий (Chan E, Mackenzie А., 1986; Султанов Г. В. и соавт., 1987; Riedel В. et al., 1987; Dent J., McNalty С, 1988), средах для выращивания и определения уреазной активности С. pylori (Cellini L. et al., 1992) и индикаторных средах (Queiroz D. et al., 1987 и др.). Bolton E et al. (1988) на основании сравнительных исследований эффективности различных сред для выделения из фекалий кампилобактерий рекомендуют модифицированный агар ССД с амфотерицином. Во многие среды для выделения С. jejuni добавляется Campylobacter-селективный комплекс антибиотиков фирмы «Oxoid», включающий 2 мг/л амфотерици-наВ.
Гаджиева Е Р. и соавт. (1989) предлагают оригинальную среду для выделения U. urealyticum, включающую в свой состав и амфотерицин.
Mitchison D. et al. (1972, 1973) усовершенствовали селективную для микобактерий агаровую среду 7Н10 добавив в нее среди других антибиотиков и 10 мкг/мл амфотерицина В.
По данным Thomas С. et al. (1989) добавление в различные нерадиоактивные жидкие среды амфотерицина В ингибировало рост М. avium-intracellulare, M. xenopi, M. kansasi и М. fortuitum. Этот антибиотик входит в состав сред PACT и PANTA для выявления микобактерий (Tice L., Roberts G., 1986; Siddigi S., Hwang-bo C, 1986; Libonati J. et al., '986).
Левомицетин. При выборе антибиотиков в средах для выделения шигелл учитывают антибиотикограммы выделяемых в данной местности штаммов (например к левомицети-ну у нас в стране). Рекомендуется добавлять левомицетин в наиболее часто употребляемые в лабораториях среды Плоски-рева и Левина, т. к. в последние годы среди шигелл доминируют варианты устойчивые к ним (Черномордик А. Б. и соавт., 1976).
К левомицетину чувствительны 59,4% штаммов цитробакте-ров, выделенных из фекалий людей и из внешней среды (Сады-кова М. Ш. и соавт., 1986).
При выявлении патогенных микроорганизмов иммунофлуо-ресцентным анализом рекомендуется подращивание исследуемых материалов на простых или элективных средах, в качестве которых можно применять МПБ с левомицетином (Наставления..., 1969).
Новобиоцин. При выборе антибиотика в средах для выделения шигелл учитывают их антибиотикограммы (новобиоцин, ампициллин и др.за рубежом, например в среде Мак-Конки).
В качестве селективных агентов в средах для выделения Ps. aeruginosa используют новобиоцин в сочетании с пенициллином (Sands D., Rovira А., 1970). Azad H, Cooksey D. (1995) разработали для изоляции Ps. savastanoi высокоселективный агар ОКА, обладающий хорошими ростовыми свойствами и содержащий из антибиотиков также новобиоцин.
Mattar S. (1994) оценивали эффективность выделения различных энтеробактерий (Е. coli, Salmonella sp., Shigella sp.) на ряде сред, в том числе на бриллиантовом зеленом-глицерин-ново-биоцин-лактозном агаре. Salmonella sp. обнаруживались в 77,2% на этой среде, которая является селективной для Shigella sp. (100%).
Для лабораторной диагностики вибриоза Центральной ветеринарной лабораторией рекомендована (1979) сафранино-железо-новобиоциновая (СЖН) среда Голикова А. В. и соавт. (1969).
Используя среду NNS, содержащую новобиоцин, нитрат натрия и сахарозу, Tondella M. et al. (1989) дифференцировали урологические штаммы St. saprophyticus от других видов коагулазоо-

46
47
трицательных стафилококков. Чувствительность метода95,5%, специфичность100%.
Watts J. et al. (1991) показали возможность использования посева в бульон с арабинозой и целлобиозой при скрининге штаммов коагулазоотрицательных стафилококков, устойчивых к но-вобиоцину.
По данным Yabu К. (1991) при добавлении к 6-часовой культуре St. aureus новобиоцина в концентрациях, подавляющих микробный рост, вместо крупных везикулярных телец образовались малые тельца без везикул. Выживаемость культур снижалась. Одной из сред для выделения и идентификации стафилококков, представленных в методических рекомендациях Вальвачева Н. И. и соавт. (1984) является среда для определения устойчивости к новобиоцину.
Ампициллин. Жога Л. К. и соавт. (1995) сконструировали транспортную среду для патогенных псевдомонад в состав которой входили в качестве ингибиторов антибиотики и красители ампициллин0,01г/л; полимиксин0,0025 г/л; генциановый фиолетовый0,0025 г/л. Ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры не влияли на возбудителей сапа и мелиоидоза, устойчивых к ампициллину (MIC 250500 мкг/мл), полимиксину (1000 мкг/мл) и генциановому фиолетовому.
При выборе селективных агентов при выделении шигелл учитывают антибиотикограммы местных штаммов (новобиоцин, ампициллин и др.за рубежом, например в среде МакКонки). По данным Jorgensen J. et al. (1987) MIC ампициллина на среде HTM несколько выше, чем на других.
Lambert Т. et al. (1986) установили высокую ингибирующую способность С. pylori к ампициллину.
Агар ОКА для изоляции Ps. savastanoi (Azad H., Cooksey D., 1995) содержит, помимо других антибиотиков, также 0,015 г/л ампициллина.
Для выделения Aeromonas рекомендуется агар с бараньей кровью (эритроцитами), дополненный ампициллином (Mish-ra S. et al., 1987). Для того, чтобы не пропустить ампициллин-чувствительные штаммы Aeromonas и негемолитические А. са-viae, авторы рекомендуют использовать комбинацию среды с ампициллином и среды, содержащей ДНК-аза-толуидин голу-бой-ампициллин 10 мг/л. Abeyta С. et al. (1986) получены высокие результаты по выявлению A. hydrophila из образцов окружающей среды с использованием триптического соевого бульона с ампициллином (TSBA). Во все среды предложенные Jeppesen С. (1995) для количественной оценки Aeromonas spp. из образцов продовольствия входит ампициллин и наилучшей из них является крахмал-ампициллиный агар (starch ampicillin agarSAA), хотя можно использовать и другие: ампициллин-желчные соли-инозитол-ксилозный агар (ampicillin bile salts inositol xylose-MIX agar), ампициллин-декстриновый агар (ampi-
cillin dextrin agarADA), крахмал-глутамат-ампициллин-пени-циллин С-глюкозный агар (starch glutamate ampicillin penicillin C-glucose agarSGAP-ЮС) в дополнении к SAA.
Kelly M. et al. (1988) провели комплексное двухэтапное исследование по оценке 4 сред (агар МакКонки, содержащий 100 мкг/мл ампициллина и 1% твина-80; кровяной агар без и с 20 мкг/мл ампициллинаКАА; CIN-arap; а также комбинация КАА и CIN-агаров) для выделения шт. Aeromonas из фекалий, определения значения чувствительности к ампициллину в выборе культуральных сред и роли (3-гемолизина в скрининге кровяных сред для Aeromonas. Комбинация КАА и CIN-arapa позволяла добиться 100%-ого выделения Aeromonas. Все штаммы, выявленные на кровяном агаре, были также выделены на КАА; 89% штаммов, выделенных на этой среде, обладали способностью к р-гемолизу. Отмечается, что КААнаилучшая среда для выделения Aeromonas из фекалий, но оптимальным является использование более чем одной среды.
Klink Е., Smulder F. (1990) выделили штаммы Sal. dublin устойчивые к хлорамфениколу и тетрациклину, но чувствительные к ампициллину, канамицину, неомицину и стрептомицину.
Бурдь В. Н. и соавт. (1994) селекционировали трансформанты Е. coli на плотных средах с 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл 5 бром-4-хлор-З индолил-(3-0-галактопиранозида и 0,2 мМ изо-пропил-Р-О-тиогалактопиранозида.
Alsima M. et al. (1994) предлагают осуществлять предположительную идентификацию V. anguillaram на дифференциальной среде VAM (наличие желчных солей, ампициллина, высокий рН и большая концентрация хлорида натрия).
Chang Т. (1995) разработал селективную среду для изоляции Phellinus noxius, содержащую 20 г/л солодового экстракта, 20 г/л агара, 10 мг/л беномила, 10 мг/л дихлорана, 100 мг/л ампициллина и 500 мг/л галловой кислоты. Для изоляции P. noxius из почвы добавляли 1000 мг/л тертигола NP-7 с целью ограничения отдельных колоний. Сравнение этой среды с другими используемыми для изоляции гименомицетов показало большую эффективность ее для изоляции P. noxius.
Тетракциклин. При разработке сред с антибиотиками для выделения шигелл необходимо учитывать антибиотикограммы местных штаммов (тетрациклин, стрептомицин, левомицетину нас в стране).
Lambert Т. et al. (1986) установили наибольшую ингибирующую активность для С. pylori у 7 антимикробных препаратов из 20, в том числе у тетрациклина, при посеве материала из слизистой оболочки желудка на шоколадный агар или среду для выделения бруцелл с 10% крови барана.
Woodford N., Ison С. (1988) определяли на агарах для диагностического теста чувствительности с 5% лизированной кро-

48
49
ви лошади с 1% изовиталекса (IsoVitaleX): (рассматривался как стандарт) и без него; GC и Proteose № 3 с 1 % гемоглобина чувствительность различных штаммов N. gonorrhoeae к пенициллину, цефуроксиму тетрациклину и эритромицину. Различий у двух первых агаров не обнаружено. На агаре Proteose по сравнению со стандартом MIC ко всем антибиотикам, кроме эритромицина, была снижена. На агаре GC гонококки были менее чувствительны к эритромицину и более чувствительны к тетрациклину по сравнению со стандартным агаром. Однако влияния агара GC на чувствительность к р-лактамным соединениям не обнаружено, хотя MIC были несколько выше, чем на стандартной среде.
Dillon J. et al. (1987) показали отсутствие влияния добавления гемоглобина к средам на величину MIC пенициллина, спектиномицина и эритромицина, тогда как MIC тетрациклина на среде с гемоглобином была на два и более разведения выше.
Vidic В. et al. (1993) исследовали чувствительность Bord. bron-chiseptica к различным антибиотикам и терапевтическим агентам, в том числе к тетрациклину при культивировании на следующих агарах: кровяной; МакКонки, содержащий 1% декстрозы; Эндо; триптон-соевый, пептонный, Bordet-Gengou, древесно-угольный и FC. Последний содержал 10 г/л пептона; 10 г/л лактозы; 10 г/л глюкозы; 3 г/л мясного экстракта; 1,5 г/л желчных солей; 5 г/л NaCl и 6,6 мл/л 0,2%-ого фенолового красного, рН-7,4.
Klink E., Smulder F. (1990) выявили намного большую эффективность среды Раппапорта-Вассилиадиса в сравнении со средой Мюллера-Кауффмана при выделении'Sal. dublin из печени, почек и мышц откормленных телят. Все выделенные штаммы были устойчивы к хлорамфениколу и тетрациклину.
Стимулирующим эффектом на синтез термолабильного эн-теротоксина Е. coli обладают сублетальные дозы линкомицина и тетрациклина (Yoh M. et al., 1983). По этой причине Мартынен-ко Л. Д. и соавт. (1994) при глубинном культивировании этого микроорганизма в МПБ дополнительно вводили, кроме прочих компонентов, 15 мг тетрациклина и 90 мкг/мл линкомицина для усиления синтеза энтеротоксина (Степанова М. В. и соавт, 1985).
По данным Садыкова М. Ш. и соавт. (1986) 59,4% штаммов цитробактеров чувствительны и к тетрациклину.
Мультиустойчивость к антибиотикам у видов рода Vibrio встречается редко, однако, уже выделены штаммы устойчивые к тетрациклину (Khemiri F. et al., 1991).
Friis N., Szancer J. (1994) показали значительное интибирова-ние рядом сильнодействующих антимикробных агентов, в том числе тетрациклином, М. hyosynoviae, M. hyopneumoniae, M. dis-
par и М. bovis при использовании тестирующей жидкой среды и дискового анализа.
Lenovich L. et al. (1984) сравнили 4 среды для подсчета дрожжей и плесневых грибов в инфицированных сухих продуктах. На среде PDA с хлортетрациклином и хлорамфениколом (CCPDA) отмечались разрастание колоний большинства выделяемых плесневых грибов и сильно спорулирующий воздушный мицелий Mucorales. На среде CCPDA, содержащей 2,5 мкг/мл дихло-рана, имело место разрастание колоний Aspergillus flavus, Al-ternaria и Paecilomyces.
Hastings J. et al. (1986) определяя количество плесневых грибов в пище на общей среде TPDA (PDA «Difco» и 40 мг/мл тетрациклина) и селективной среде DRBC, сделали вывод, что при сходных результатах на TPDA легче распознать род по типу колоний. Однако недостатком этой среды является чрезмерный рост грибов Mucor и рекомендуется использовать ее при высокой контаминации образцов Rhizopus и Mucor.
Deak Т. et al. (19866) представили результаты сравнительного исследования двух референс-сред DG18 и DRBC, изготовленных фирмой «Oxoid», с 3 средами, приготовленными в научно-исследовательских лабораториях для рутинной работы. Все 3 среды имели одинаковую основуглюкозо-дрожжевой агар. Но к среде OGY добавляли окситетрациклин, к среде CGYхлорамфеникол, а среда AGY (подкисленный глюкозо-дрожжевой агар) имела тот же состав, что и OGY, но без окси-тетрацилина. За исключением двух случаев не отмечались значительные различия в исследованных средах. При количественном определении плесневых грибов в непросеянной муке наибольшее количество их получено на CGY, тогда как с пшеничной мукой результат был хуже на AGY, чем на любой другой среде. При количественном определении дрожжей не выявлено различий в качестве сред.
Dijkmann К. (1986) изучал достоинства и недостатки сред DG18, DRBC производства «Oxoid», OGY и OGGY (OGY с гентамицином) для количественного определения дрожжевых и плесневых грибов при исследованшг сырого мяса. В качестве основных ингибиторов для бактерий использовали хлорамфеникол, окситетрациклин, гентамицин. а для ограничения распространения грибовбенгальский розовый и/или дихлоран. Среда DG18 обеспечивала наилучшие результаты для дрожжевых грибов, достаточно подавляла рост бактерий, проста в приготовлении, но ингибировала рост и некоторых плесневых грибов. Среда OGY также эффективна при количественном определении дрожжевых и плесневых грибов, но ненадежна в качестве дифференциальной среды. OGGY достаточно подавляет рост бактерий и может быть использована для количественного подсчета дрожжевых и плесневых грибов в сыром мясе, домашней птице и рыбе, которые обычно сильно контами-

50
*

нированы бактериями. Среда DRBC должна иметь более ограниченное применение.
Алексиева В., Ненков М. (1988) провели сравнительные исследования с целью установления качества и пригодности пивного агара и окситетрациклин-гентамицин-дрожжевого агара (OGY) с экстрактом глюкозы для количественного определения плесеней и дрожжей в молочных продуктах. Установлена большая пригодность среды OGY, в сравнении с пивным агаром, благодаря повышенной селективности и выявлению большего числа проб молочных продуктов, контаминирован-ных дрожжами и плесенями, а выросшие на этой среде колонии крупнее и легче распознаются по морфологической характеристике. Рекомендуется стандартизировать OGY по Болгарскому стандарту 1670-82.
Фузидин. У нас в стране входит в состав среды ЖЭКА (Султанов Г. В. и соавт., 1987) для выделения кампилобактерий.
ЦеФалотин. Сотирова П., Александрова Ст. (1989) определяли распространенность С. jejuni у цыплят посевом проб на среде, аналогичной по составу агару Колумбия («Difco») с добавлением по 2500 мг/л сульфата железа и пирувата натрия, 50 мл/л овечьей крови и антибиотиков: 10 мг/л ванкомицина, 5000 VI полимик-сина и 30 мг/л цифалотина. Выращивание осуществлялось в микроаэрофильных условиях. Цефалотин входит в состав сред ЖЭКА (Султанов Г. В. и соавт., 1987), используемой у нас в стране, и ПА№ 3, применяемой в Чехословакии. Поданным Черкасского Б. Л. и соавт. (1989) чувствительность указанных сред равноценна.
Рифампипин. С целью разработки селективной среды для выделения лептоспир из клинического материала, контамини-рованного посторонней микрофлорой, Adler В. et al. (1986) определяли MIC 14 антибиотиков в отношении лептоспир серо-варов pomona и Sardjo, а также стандартных штаммов В. cereus, Ps. aeruginosa, St. aureus, Str. faecalis, Sacch. cerevisiae и Mu-cor sp. На основании полученных результатов предлагается рецептура полужидкой твин-альбуминовой среды EMJH, в состав которой включены актидион, бацитрацин, 5-фторурацил, неомицин-сульфат, полимиксин В и рифампицин в концентрациях 0,1; 0,04; 0,25; 0,0002 и 0,01% соответственно.
В связи с низкой эффективностью имеющихся сред для выделения термофильных кампилобактерий (С. jejuni и С. coli) из фекалий, Голиков А. В., Зенин И. В. (1980) предлагают селективную среду на основе сердечно-мозгового отвара, который по литературным данным наиболее полно отвечает питательным потребностям кампилобактерий. Селективными компонентами ее являются рифампицин, подавляющий рост грампо-ложительных и грамотрицательных микроорганизмов; полимиксин М, активный в отношении грамотрицательных микроорганизмов, и противогрибной препарат нистатин-по
1 мл растворов рифампицина (10 мкг/мл), полимиксина М (1 мкг/мл) и натриевой соли нистатина (25 мкг/мл) на 1 л среды. Эти препараты не подавляют рост термофильных кампилобактерий (MIC более 100 мкг/мл). Среда ПСТК оказалась эффективнее более чем в 3 раза среды ВИЭВ при выделении термофильных кампилобактерий.
Schulze F. et al. (1987) выделяли и дифференцировали бактерии p. Campylobacter на агаре Мюллера-Хинтона с добавлением 10% телячьей крови, 5000 МЕ/л полимиксина В и по 10 мг/л рифампицина и триметоприма. Отмечена высокая избирательность предлагаемой среды.
Колтс К. К. и соавт. (1990) в среды для выделения С. pylori (кровяной агар для бактероидов и тиогликолевую среду с резазуриновым индикатором) добавляли полимиксин М 40000 ЕД/л, бисептол5 мг/л, рифампицин10 мг/л (Patton С. et al., 1981; Bolton F. et al., 1984). На плотной среде вырастали колонии кампилобактерий светло-коричневые, блестящие, полувыпуклые и полупрозрачные, а жидкая среда при наличии кампилобактерий становилась коричневой и выпадал беловатый осадок. Результаты посевов оказались примерно одинаковыми, но жидкая среда с антибактериальными препаратами в некоторых случаях (21,4%) не угнетала рост стрептококков и дрожжей и, наоборот, в 19% случаев подавляла рост кампилобактерий. Преимуществом же ее можно считать более быстрый рост кампилобактерий.
Рифампицин входит в состав среды ЖЭКА.
Ванкомипин (ристоцетин). 10 мг/л этого антибиотика входят в комбинацию селективных агентов по Скирроу (Skirrow) для кампилобактерий.
Среда для выращивания и определения уреазной активности у С. pylori Cellini L. et al. (1992) с основой из агара Колумбия для селективности имеет антибиотик ванкомицин.
Сотирова П., Александрова Ст. (1989) определяли распространенность С. jejuni у цыплят посевом проб на агаре Колумбия («Difco») с добавлением, помимо других компонентов, 10 мг/л ванкомицина.
Chan E, Mackenzie A. (1986) провели оценку селективных сред и методов обогащения для выделения видов Campylobacter. Образцы фекалий высевали на 5 питательных средах: агарах для Brucella и Колумбия, жидкой и полужидкой средах обогащения, состав которых включал смесь антибиотиков, куда входил и три-метоприм.
Ванкомицин входит в состав используемой в Чехословакии для выделения кампилобактерий среды ПА № 3.
Технической находкой разработанной ими среды для изоляции и роста гонококков Evans G. et al. (1989) считают комбинацию линкомицина с ванкомицином, что позволило снизить концентрацию последнего и, тем самым, выявить рост ванкомицин-

52 ф
53
чувствительных гонококков. Однако снижение концентрации антибиотика в ряде случаев стимулирует рост ванкомицинчувст-вительных штаммов стафилококка, в то время как часть ванко-мицинчувствительных штаммов гонококка продолжает подавляться и более низкой концентрацией ванкомицина. Отмеченные недостатки снижают селективные и диагностические свойства среды.
1 мкг/мл ванкомицина содержит среда, предложенная Wa-dowsky R., Yee R. (1981) и являющаяся, по мнению Edelstein P. (1982), лучшей при изоляции L. pneumophila из питьевой воды. Такое же количество антибиотика содержит угольно-дрожжевой агар для выделения данного микроорганизма (Тартаков-ский И. С. и соавт., 1983).
Для создания селективных условий при выделении гемо-фильных палочек также используется ванкомицин (цит. по Фау-стовойМ. Е., 1980).
По данным Kunimoto D. et al. (1986) в Кении для идентификации Н. duckreyi применяются различные среды (обогатительная гонококковая, агар Мюллера-Хинтона и модифицированная среда Bieling), с добавлением во всех случаях 3 мг/л ванкомицина.
Триметоприм. Schulze E et al. (1987) добавляли 10 мг/г этого антибиотика в агар Мюллера-Хинтона при выделении и диффе-ренцировке кампилобактерий. 5 мг/л триметоприма входит в комбинацию селективных агентов по Скирроу (Skirrow), а также в состав среды ПА № 3.
Chan E, Mackenzie A. (1986) провели оценку селективных сред обогащения для выделения видов Campylobacter, жидкой и полужидкой, состав которых включал смесь антибиотиков, куда входил и триметоприм.
Триметоприм содержится в среде для изоляции и роста гонококков Evans G. et al. (1989), а также в средах Si и Si для выделения флуоресцирующих псевдомонад (Gould W. Et al., 1985).
Ярощук В. А и соавт. (1985) предлагают при выделении сибиреязвенного микроба из молока добавлять в агар Хоттингера триметоприм.
Эритромицин. По данным Cummings M. et al. (1987) добавление смеси антибиотиков, включающей 100 мкг/мл эритромицина, в среду SP-4 повышало эффективность выделения М. homi-nis.
Кроме перечисленных, в бактериальных средах используются также кларитромицин, аугментин (амоксициллин+клавула-новая кислота), бисептол, триметоприм/сульфометоксазол, ба-цитрацин, клаксоциллин, актидион, бацитрацин, 5-фторурацил, неомицина сульфат, фурагин, этоний и др.
2. ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады
К роду Pseudomonas относятся 18 видов (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. cepacia, Ps. mallei, Ps. pseudomallei, Ps. fic-ketti, Ps. stutzeri и др.), которые могут вызвать тяжелые формы инфекций как внутрибольничных, так и ятрогенных типов. Наибольшую важность для медицины и ветеринарии представляют Ps. aeruginosa, Ps. mallei и Ps. pseudomallei. Эти микроорганизмы неприхотливы по питательным потребностям и способны выживать в условиях окружающей среды (Hansen W., 1991). Ps. aeruginosa сохраняет жизнеспособность почти при полном отсутствии источников питания (Toth D. et al., 1983).
Физиология, биохимия и родо-видовые дифференциально-диагностические признаки псевдомонад обобщенно представлены в работах Palleroni (1984), Рубан Е. Л. (1986), Мороз А. Ф. и соавт. (1988), Белякова В. Д. и соавт. (1990), Смирнова В. В., Киприановой Е. А. (1990). Достаточно успешными оказались попытки использования с диагностической целью способности псевдомонад ассимилировать отдельные органические вещества. В результате спектры углеродного питания также эффективно применяются при идентификации, как и «пестрые ряды» для энтеробактерий (Смирнов В. В., Киприанова Е. А. (1990).
Отмечается бесперспективность разработки универсальных сред на основе антибиотиков и красителей для селективного выделения псевдомонад и быстрой их дифференциации от других грамотрицательных бактерий, так как диапазон видовой чувствительности псевдомонад к этим агентам очень широк (Смирнов В. В., Киприанова Е. А., 1990). По этой же причине выражается сомнение в пригодности подобных сред, уже разработанных Grant M., Holt J. (1977), Wakisaka Y., Koizumi К. (1982).
Между тем, большие возможности в плане создания универсальных сред открывает использование ЭДТА и солей бария, избирательно подавляющих различные виды Pseudomonas, независимо от чувствительности их к антибиотикам и красителям.
До сих пор не существует строго регламентированного набора тестов для идентификации Ps. aeruginosa. Как не утративший способности к сапрофитизму, он характеризуется выраженной биохимической активностью, обладает необходимым для дыхания набором ферментов, восстанавливает нитраты в нитриты, редуцируя их до газообразного азота, хотя последний тест, по данным Girardi G (1980) может быть отрицательным у 42% штаммов. Характерным биологическим признаком Ps. aerugi-

ч
55
nosa, значительно упрощающим идентификацию приблизительно 7080% штаммов, является уникальная способность синтезировать водорастворимый феназиновый пигментпиоцианин, окрашивающий питательную среду в синезеленый цвет. Кроме того, большинство культур образует зеленый, флуоресцирующий в Уф лучах, пигмент флуоресцеин или пиовердин, а также другие пигменты (пиорубин, пиомеланин, аоксифеназин). В некоторых случаях выявляются атипичные беспигментные (818%) или слабопигментированные формы (Мороз А. Ф. и соавт., 1988), что объясняется действием сопутствующей микрофлоры, антибиотиков, недостатком кислорода. Имеется основание считать мела-нинобразующие штаммы более патогенными (Рожавин М. А., 1983).
Уникальным свойством Ps. aeruginosa является способность образования на плотных средах блестящего металлического налета (само название «aeruginosa» означает «покрытая налетом цвета медной ржавчины»). Однако это свойство встречается нестабильно у всех штаммов данного вида и Калина Г. П. (1984) подробно анализирует литературу о влиянии на выявление этого признака состава среды культивирования. Автор экспериментально проверил многочисленные комбинации различных компонентов, используемых в средах (триптон «Difco», глицерин, сульфат калия, хлорид магния, нитрат калия, аргинин, аспарагин, молоко), а также непосредственно среды для интенсификации блеска (МПА с 5% человеческой крови, среда с хлоридом N-цетилпиридиния, трехсахарный железный агар, две среды Берка: повышенной питательности за счет увеличения содержания триптона и с меньшим содержанием последнего, но с введением в состав аргинина). В результате разработана среда, содержащая МПА с повышенной концентрацией пептона, молоко, 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлорид и L-аргинина монохлорид, на которой Ps. aeruginosa, за единичными исключениями, образует металлический блеск высокой интенсивности. На практике можно упростить среду заменив МПА сухим порошковым агаром и исключив пептон, аргинин.
Идентификация беспигментных и слабопигментных штаммов Ps. aeruginosa может быть упрощена использованием сред, предложенных King E. (1954) для усиления образования пиоциа-нина (среда Кинга А) и флуоресцеина (среда Кинга В), а также сред Калиной Г. П. (1984) и Daly J. et al. (1984).
Ps. aeruginosa хорошо растет и размножается на простых питательных средах в аэробных условиях при 3037°С и сохраняет эти свойства при 42°С. На поверхности питательного бульона или пептонной воды культуры образуют серовато-серебристую пленку. На МПА, средах Эндо или Плоскирева различают 5 типов колоний: плоские неправильной формы, типа Е. coli, складчатые, слизистые и карликовые.
Ps. aeruginosa обладает слабой сахаролитической активностью и получает энергию путем окисления самых разнообразных субстратов-сахаров и других углеводов. Окисление одного и того же вещества может происходить по разному в зависимости от условий, при этом гликолиз и цикл Кребса не являются единственными механизмами биохимического превращения углеводов. Глюкоза может окисляться до 2-кетоглюконовой кислоты без образования газа в аэробных условиях, тогда как в анаэробных ферментации глюкозы вообще не происходит. При длительной (23 сут) инкубации все штаммы окисляют ксилозу, арабинозу, маннозу (Анохина Р. В., 1973) и выявляют ос-га-лактозидазу (Исхакова X. И., 1980). Возбудитель инертен к лактозе, сахарозе, манниту, мальтозе (Lanyi В., 1968) и индолотри-цателен (Исхакова X. И., 1980). Протеолитические свойства, наоборот, хорошо выражены: разжижение желатина, свернутой кровяной сыворотки, гидролиз казеина. Родовым признаком является синтез цитохромоксидазы. Цитохромоксидазная пробадостаточно надежный тест для идентификации штаммов Ps. aeruginosa. Этот микроб синтезирует триметиламин, придающий культурам своеобразный запах, напоминающий жасмин, земляничное мыло или карамель.
В качестве таксономического для Ps. aeruginosa признака До-марадский И. В. (1975) рассматривает феномен радужного лизиса при росте на плотных средах.
Нетребовательность к питательным веществам дает возможность изолировать его на любых достаточно простых жидких и плотных средах. Однако, являясь ведущим возбудителем в патологическом материале, Ps. aeruginosa довольно часто находится в ассоциации с другими микроорганизмами, поэтому для его одноступенчатого выделения используется целый ряд элективных и дифференциально-диагностических сред. Они должны содержать химические соединения, являющиеся либо источником питания только для синегнойной палочки, либо подавляющие рост ассоциативной микрофлоры, не задерживая при этом ее собственный рост.
К 1-ому типу можно отнести среды с ацетамидом( Буль С. М., Колкер И. И., 1978; Hedberg М., 1969; Mossel D. et al., 1976), который используется Ps. aeruginosa в качестве источника азота и углерода, в отличие от других грамотрицателъных микроорганизмов и остальных видов рода Pseudomonas. Hedberg M. et al. (1969) рекомендуют для выделения из мочи и отделяемого гнойных ран среду Симмонса с заменой цитрата натрия на ацетамид (2%), поскольку на ней полностью подавляется рост культур протея. В то же время, Шеина Э. П., Арутчева А. А. (1979) вновь предлагают выделять Ps. aeruginosa из ассоциации с протеем просто на среде Симмонса.

56
57
Korth S. (1963) предложил хинно-кислую среду для идентификации Ps. aeruginosa и Ps. fluorescens, исходя из способности их использовать хинную кислоту в качестве источника углерода.
Однако большинство разработок селективных сред ориентировано на химические соединения, ингибирующие рост бактерий- ассоциантов Ps. aeruginosa. В связи с резистентностью к нитрофурановым препаратам для его выделения предложены питательные среды, в состав которых вводится одно из соединений названной группы (Черномордик А. Б., 1971; Carlevaro С. et al., 1963; Thom A. et al., 1971). Наибольшее распространение за ру-бежом получили сухие среды, содержащие в качестве селективного агента цетилтриметиламмоний бромид или цет-римид (Aldridge С. et al., 1964; Brown V, Lowbury E., 1965; Mos-sel D. et al., 1976; Negretti E, Trabattoni C, 1984), 2, 4, 4-три-хлоро-2-гидроксифеноловый эфир или иргазан (Robin Т., Jan-da M., 1984).
В нашей стране для одноступенчатого выделения Ps. aeruginosa предложены среды: синтетическая с фурагином (Ароне Р. М., Чурсина Т. В., 1975), накопительная с бриллиантовым зеленым (Кол-кер И. И. и соавт., 1977; Жарикова М. С. и соавт., 1983), с пропа-нидом (Алешня Е. П., Алешня В. В., 1977), А-1 и А-2 (Исхако-ва X. И., 1979), с этонием и пенициллином (Тыдельская И. Л. и соавт., 1980), с солями четвертичного аммониевого основания (Мороз А. Ф. и соавт., 1976).
Способ, предложенный Алешня Е. П., Алешня В. В. (1977), не получил распространения, видимо, из-за дефицитности про-панида.
Разработанная на основе смеси этония (выпускаемый в России детергент, применяемый в медицине главным образом как противостафилококковый препарат) с пенициллином среда обладает неплохими селективными свойствами: на ней ингибиру-ется рост не только стафилококков и стрептококков, но и бацилл, кишечных палочек, протея; и лишь в единичных случаях вырастают культуры цитробактера и клебсиеллы. К недостаткам указанной среды относятся многокомпонентность и невозможность длительного (более 2 нед.) хранения готового состава в холодильнике из-за инактивации пенициллина (Рожавин М. А., Бугаева Е. А, 1986).
Zacharian P., Listen J. (1973) установили рост Ps. aeruginosa на «голодном» агаре с (3-аланином, глицином или пролином в качестве источника азота. Добавление фурагина вызывало угнетение развития других микроорганизмов, но не влияло на рост Ps. aeruginosa.
Liu P. van (1973) рекомендует среду, содержащую белковую основу, глюкозу, NaCl, фосфат калия двузамещенный и воду.
В НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи (Москва) разработана сухая среда, состоящая из селектив-
ного агента отечественного производстваN-цетилпиридиния хлорида (N-ЦПХ) в концентрации 0,2% (Мороз А. Ф. и соавт., 1976), а также питательной основы из сухого пептического гид-ролизата казеина и минеральных солей магния, калия. Детергент N-ЦПХ в концентрации 0,20,5% надежно угнетал рост стафилококков, стрептококков и энтеробактерий. Однако, при этом ингибируются и отдельные клинические штаммы синег-нойной палочки. Позже для улучшения селективных свойств данной среды Мороз А. Ф. и соавт. (1980) вводили в нее фено-зан. Начат промышленный выпуск сухой среды с N-ЦПХ и фе-нозаном. По избирательности и количеству положительных высевов она превосходит зарубежные агары с иргазаном и цет-римидом (Бекбергенов Б. М., 1977; Поликарпов Н. А., 1978; Буль С. М. Колкер И. И., 1978; Раку В. Д. и соавт., 1982; Кол-кер И. И. и соавт., 1982), проста в изготовлении и стабильна при хранении. Между тем, отмечаются недостаточная чувствительность ЦПХ - агара (Каплан А. Е. и соавт., 1982) и возможность роста на ней отдельных штаммов протея и цитробактера (Колкер И. И. и соавт., 1982).
Жарикова М. С. и соавт. (1983) провели оценку эффективности ряда жидких (Кесслера, Хоттингера и бульон с 1% глюкозы) с последующим высевом на МПА с бриллиантовым зеленым и плотных (пропанидовая, Эндо, Плоскирева и МПА с бриллиантовым зеленым) сред при пересевах с бульона Хоттингера для обнаружения Ps. aeruginosa. Из жидких сред наилучшие результаты получены с использованием бульона Хотингера, а наихудшие со средой Кесслера. Из плотных сред наилучшие результаты получены на пропанидовой среде, сопоставимые между собойна среде Эндо и МПА с бриллиантовым зеленым, а худшиена среде Плоскирева. При сравнительном изучении ингибирующей способности сопутствующей микрофлоры у сред Симмонса, МПА с бриллиантовым зеленым, ацетамидной, пропанидовой, Эндо, Плоскирева и висмутсульфитном агара (контролем служил МПА), показано отсутствие на всех них роста St. aureus, споровых аэробных бацилл. Е. coli не дали роста на первых 4 средах, на висмут-сульфитном агаре и среде Плоскирева число колоний было в 23 раза меньше, чем в контроле, а результаты посевов на среде Эндо совпадали с контролем. Наибольшим ингибирую-щим свойством относительно протея (роящихся штаммов) обладали МПА с бриллиантовым зеленым и среда Симмонса. Слабее ингибировала среда с ацетамидом и не ингибировали среды с пропанидом и Плоскирева. Ростовые качества первых 5 сред были примерно одинаковыми и сопоставимыми с контролем, тогда как на среде Плоскирева и висмут-сульфитном агаре интенсивность роста была в 2 раза меньше.
Отмечают возможность замены МПА с бриллиантовым зеленым на одну из следующих сред: Симмонса, ацетамидный или пропанидовый агар.

58
59
Считается, что на вторые сутки можно идентифицировать около 75% культур Ps. aeruginosa по морфологии колоний и образованию сине-зеленого пигмента, а остальную часть на 3-ьи сутки. Однако в связи с чувствительностью к ингибиторам определенного количества клинических изолятов этого микроорганизма, особенно выделяемых от больных с кистоз-ным фиброзом (до 9%), полагают необходимым, с целью повышения эффективности выявления возбудителя, проводить посевы на селективные и неселективные среды (Fonseca К. et al., 1986).
Отечественным лабораториям МЗ СССР для выделения Ps. aeruginosa рекомендованы в качестве унифицированных ЦПХ-агар и ацетамидный агар (приказ № 535 от 22.05.85, приложение 1).
Таким образом, по Мороз А. Ф. и соавт. (1988) наиболее информативными и доступными для лабораторий тестами идентификации Ps. aeruginosa являются рост на среде с N-ЦПХ, положительный цитохромоксидазный тест, способность окислять глюкозу на среде Хью-Лейфсона в аэробных условиях и расти на ацетамидном агаре. Посев на среды Кинга А и В позволяет дополнительно идентифицировать 510% штаммов по образованию характерных пигментов.
Evans M. et al. (1986) исследовали чувствительность Ps. aeruginosa к 7 антибиотикам методом микроразведений в 10 видах жидких сред, главным образом являющихся модификациями бульона Мюллера-Хинтона. Чувствительность к карбеницилли-ну, тикарциллину и пиперациллину слабо варьировала на различных средах. Значительные отличия обнаружены в тестах с мо-ксалактамом и аминогликозидами. Добавление к бульону Мюллера-Хинтона сыворотки человеческой крови приводило к появлению 1450% ложноположительных результатов чувствительности Ps. aeruginosa к моксалактаму. На триптиказо-соевом и питательном бульонах, бульоне для бруцелл обнаружено 1072% случаев ложной устойчивости к аминогликозидам. Результаты подтвердили необходимость строгого выполнения рекомендаций, в соответствии с которыми чувствительность Ps. aeruginosa к антибиотикам следует определять на бульоне Мюллера-Хинтона, стандартизированном по содержанию двухвалентных катионов.
Федорина А. П. (1987) использовала для селекции Ps. aeruginosa сахарный бульон с добавлением 0,220,66 мг/мл сульфата цинка.
Gill V, Stock F. (1987) предлагают среду PFA для одновременного выявления пиоцианинового и флуоресцеинового пигментов Ps. aeruginosa, превосходящую другие аналогичные и состоящую из 15 г/л дегидрированного МН-агара («Difco»), 12 г/л желатинового пептона («Becton Dickinson»), 8 г/л сульфата калия,
5 мл/л глицерина, 1,5 г/л MgCh*6I-LO и 13 г/л агара; рН среды доводят до 7,2. Учитывая, что во многих практических микробиологических лабораториях пиоцианин расценивается как 1 из основных видовых признаков Ps. aeruginosa, среда PFA поможет, по мнению авторов, упростить и ускорить процедуру его первичной идентификации.
Keeven J., De Cicco В. (1987) разработали селективную среду для выделения Ps. aeruginosa (высеваемость 100%), в состав которой входят 15 г/л соевого с переваром казеина бульона; 15 г/л агара, 0,1 г/л фенантролина. Рост Ps. fluorescens и Ps. putida наблюдался в виде мелких колоний и в более поздние сроки, чем Ps. aeruginosa. Рост других псевдомонад, грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей полностью ингибиро-вался. Состав среды более прост и она дешевле, чем ранее разработанные для выделения Ps. aeruginosa среды Pseudosel Agar и Pseudomonas Isolation Agar.
Tomas J., Oliver-Rodes B. (1987) рассматривали вопрос об оптимальных концентрациях селективного агента в питательной среде.
Campbell M. et al. (1988) разработали селективную среду для выделения Ps. aeruginosa, состоящую из агара Колумбия, в который добавлены фенантролин, 9-хлор-9-/ 4- (диэтиламино)- фе-нил/-9, 10- дигидро-10-фенилакридингидрохлорид (С-390) до конечной концентрации 30 мкг/мл каждый. Она превосходила селективные среды с фенантролином, С-390, ацетамидом и цет-римидом.
Гивенталь Н. И. и соавт. (1989) определяли чувствительность Ps. aeruginosa к антибиотикам в жидкой синтетической питательной среде.
Для выявления Ps. aeruginosa Schubert R. (1989) предлагает среду ABGP из пептонного бульона с глюкозой, аргинином и бриллиантовым зеленым, включающую следующие ингредиенты (г/л): казеиновый пептон17; пептон из соевых бобов3; NaCl5; сульфат аргинина10 и глюкоза0,5. После стерилизации и охлаждения в среду добавляют 10 мл крезолово-го красного (0,3%-ый раствор); 7,5 мл бромтимолового синего (0,2%-ый раствор) и 0,075 мл бриллиантового зеленого (0,5%-ый раствор). Рост Ps. aeruginosa в среде с аргинином в течение 48 ч при 37°С сильно зашелачивает ее, в результате чего серовато-зеленая окраска индикатора в среде изменяется до сине-фиолетовой. Бриллиантовый зеленый в использованной концентрации подавляет рост грамположительных микроорганизмов, но не токсичен для Ps. aeruginosa. При культивировании проб более 48 ч наблюдаются ложноположительные реакции. Для получения чистых культур делается засев из жидкой среды на плотную после инкубации на ABGP в течение 24-48 ч.

60
61
Синяшин Н. И. и соавт. (1990) изучали физиологические особенности (способность пигментообразования, накопления биомассы) Ps. aeruginosa при использовании питательных субстратов, приготовленных по разным технологиям. Накопление биомассы наиболее выражено на модифицированных бульонах Мартена. Перевар по Хоттингеру уступал экспериментальным средам. Однако, окончательную оценку роли питательных сред можно дать, считают авторы, изучив антигенные комплексы су-пернатантов и самой биомассы.
Калина Г. П., Комзолова Н. Б. (1988) приводят достаточно полный обзор применения жидких сред накопления при поисках Ps. aeruginosa в объектах окружающей среды и патологическом материале. Авторы рекомендуют модифицированную среду Bonde (замена пенициллина кристаллическим фиолетовым как более мягким ингибитором), признанную официально и проверенную на большом материале. Для выделения Ps. aeruginosa из пищевых продуктов Szita G., Biro G. (1990) разработали селективную дифференциальную синтетическую среду, основанную на свойстве этого микроорганизма утилиз-ровать аммоний из неорганических источников азота. Она включает ацетамид и ацетат в качестве источников азота и углерода, соответственно. Среда высокочувствительна, стандартна, позволяет непосредственно изучать важные дифференциальные биохимические свойства, дешева, подлежит хранению, может быть приготовлена в сухом виде и пригодна для замены контрольных сред.
Сиволодский Е. П. (1990) рекомендует селективную среду «Pseudomonas APS» для одноэтапного выделения и идентификации Ps. aeruginosa и Ps. putida, обладающую «лучшей чувствительностью и избирательностью, чем перечисленные». Ее применение основано на выявленном свойстве отечественного лекарственного препарата оксафенамид (п-оксифенилсалициламид) избирательно подавлять рост бактерий.
Журило А. А. (1991) изучал эффективность новых селективных к Ps. aeruginosa и тормозящих рост сопутствующей микрофлоры агентов: легкодоступного и широко используемого в сельском хозяйстве рамрода (пропахлора, ацимида)-2 хлоризопро-пилацетамида и комплекса сульфат гидразина, грамурин, этоний, N-ЦПХ, в котором первый компонент является ведущим. Эти селективные агенты добавляли в среды РЧЖ (Чаплинский В. Я., Журило А. А., 1987) и Ж, соответственно, и сравнивали с кровяным и N-ЦПХ агарами. Среды РЧЖ и Ж не содержат дефицитных компонентов, дешевы и малотрудоемки. Технология приготовления среды РЧЖ представлена Горбуновой М. Л. и соавт. (1984). Она состоит из 7 г/л пептона; 7 г/л KSOi; 1,5 г/л MgSOt; 1,5 г/л MgCL; 12 г/л агар-агара, 40 г/л рамрода и 25 мл/л глицерина. MIC рамрода в среде РЧЖ, обеспечивающая ее селективность, равнялась 0,000350,0004 мкг/мл. Селективный ком-
плекс эффективно действовал при соотношении компонентов (г/л): пептон 1822; сульфат калия 68; сульфат магния 1,7 2,5; MgCL 1,31,7; сульфат гидразина 0,080,1; грамурин 0,06 0,07; этоний 0,003-0,005; N-ЦПХ 0,03-0,04; агар-агар 9,5-12; рН 7,27,4. Количество колоний псевдомонад на среде РЧЖ было в 1520 раз меньше, чем в контроле (МПА), тогда как на среде Ж-лишь в 1,52 раза. Колонии на среде Ж значительно крупнее, чем на других селективных средах.
Сравнительные исследования Якубчак О. Н. (1997) эффективности выделения и идентификации Ps. aeruginosa на средах с цитримидом, этонием, антибиотиками, N-ЦПХ и СА-03 показали относительно высокую их чувствительность (за исключением среды с N-ЦПХ) и селективность (среды с цетримидом и СА-03на них, помимо Ps. aeruginosa, росли только 2 вида посторонней микрофлоры). Скорость роста на всех средах была примерно одинаковой (наибольшая на средах СА-03 и с этонием). Тем не менее, с целью повышения селективности, автором разработаны среды М и Mi, особенностью которых является отсутствие ингибиторов посторонней микрофлоры, отрицательно влияющих и на собственно Ps. aeruginosa. Среды основаны на использовании мочевины (аммиака) в качестве источника азота (большинство других бактерий не могут расщеплять мочевину); глюкозыисточника углерода; сульфатаисточника серных соединений, необходимых для образования белков; аспа-рагина (в среде М он отсутствует) и ионов К+для облегчения образования пигмента.
Комзолова Н. В. (1991), оценивая факторы патогенности Ps. aeruginosa, использовала авторскую среду АгЖел 1986) при определении наличия желатиназы, 5% кровяной агаргемолизина, желточный агарлецитиназы и обезжиренное молококазеиназы.
Штаммовую зависимость накопления биомассы Ps. aeruginosa от среды выращивания установили Нуриддинова Н. Р. и соавт. (1991). Пигментообразование было наиболее интенсивным на среде из свиных и кроличьих желудков, а также на среде из свиных гузенков по сравнению со средами Мартена и Хоттинге-ра. Применение среды из кроличьих желудков способствовало появлению таксономического признака-металлического блеска с зонами лизиса и повышению антагонистической активности штаммов.
Дорофеев А. Г. (1994) выращивал Ps. aeruginosa на синтетической среде с глюкозой в качестве единственного источника углерода и энергии (Паников Н. С. и соавт.. 1980).
Культивирование Ps. aeruginosa с целью получения экзотоксина А проводят на плотных и жидких средах (Перт С, 1978; Баскакова Н. В. и соавт., 1983; Баснакьян И. А., 1989; Liu P., 1964; Arvidson S., 1973; Alouf J., 1985; Belohlavek S. et al, 1985). Чаще

62
63
всего используется бульон Мартена или триптический соевый бульон.
Аджиева А. А. и соавт. (1987) предложили для его культивирования среду, включающую белковую основу, ряд неорганических солей, а также хелатообразующий агент (дельта-оксидиа-мидоуксусная кислота), связывающий ионы металлов, входящих в активный центр металлозависимых протеиназ, блокирующих их действие на экзотоксин А. В связи с изготовлением среды в двух вариантах, рекомендуется и два способа получения экзотоксина А.
Blumentals I. et al. (1987) разрабатывали среду определенного химического состава и двухступенчатый метод культивирования, обеспечивающие увеличение выхода экзотоксина А, вырабатываемого Ps. aeruginosa. При этом шт. РА-103 растили на диализованном триптиказо-соевом бульоне, обогащенном добавлением 1% глицерина и 0,05 М глутамата натрия. Следы железа из бульона удалялись с помощью хелатора Chelex-100. Параллельно использовали синтетическую среду, включавшую набор аминокислот, солей и Сахаров в заданном соотношении. Выращивание вели в 2 этапа. На первом использовали вышеописанный обогащенный триптиказо-соевый бульон и выводили культуру на стадию раннего стационара. Затем отмытые клетки пересевали на свежий бульон, полностью освобожденный от следов железа и продолжали культивирование еще 5 6 ч. Накопление биомассы Ps. aeruginosa на бульоне шло примерно также, как и на синтетической среде, но после полного удаления Fe2+ выход биомассы с бульона возрастал. Увеличение концентрации глицерина с 2,5 до 35 г/л увеличивало выход экзотоксина А в среду выращивания с 0,8 до 2,1 мг/л. Добавление Fe2+ к бульону тормозило синтез мРНК, транслирующей информацию о синтезе экзотоксина А. Напротив, ионы Са2+ усиливали его синтез.
Кузнецова Т. Н. и соавт. (1991) оптимизировали процесс глубинного культивирования Ps. aeruginosa с целью получения экзотоксина А использовав определенную дозу экспоненциальной посевной культуры и рациональный режим аэрации.
Известно, что бактериологическая диагностика сапаопасного инфекционного заболевания человека и животных, возбудителем которого является Ps. mallei, сложна и не позволяет с уверенностью идентифицировать его среди других псевдомонад. Манзенюк О. Ю. и соавт. (1994) выращивали псевдомонады, в том числе Ps. pseudomallei, Ps. mallei и др., на плотной среде КГК, содержащей 10 мл/г глицерина; 1 г/л КНРО-сЗНгО; 1 г/л КН2РО4; 0,3 г/л MgSO* 7Н2О; 0,03 г/л FeSO* 7Н2О; недеионизи-рованный солянокислотный гидролизат казеина с аминным азотом 30±5 мг%; 15 г/л агара.
С целью обнаружения возбудителя мелиоидоза подозрительный материал обычно засевают на МПА или МПБ с 35% глицерина. Так как в патологическом материале от больных (гной, мокрота, испражнения и др.) и особенно в объектах внешней среды широко представлена посторонняя микрофлора, изолировать возбудителя мелиоидоза прямым посевом не всегда удается. Для подавления других видов микроорганизмов Miller W. et al. (1948) рекомендуют применять различные красители: кристаллический фиолетовый (1:200 000), профлавин, акрифлавин, акридин оранжевый, акридин желтый (1:500 000), фуксин основной или кислый (1:100 000), малахитовый или бриллиантовый зеленые (1:1 000 000). С этой же целью авторы предлагают добавлять в исследуемые пробы 1000 ЕД/мл пенициллина и после выдержки 3 ч при 37°С сеять на МПА с 35% глицерина.
Учитывая малую чувствительность возбудителя мелиоидоза к полимиксину и стрептомицину, Ширяев Д. Т. и соавт. (1976) рекомендуют добавлять их в питательную среду в соотношении 100 и 50 мкг/мл, соответственно, при исследовании проб из объектов внешней среды. Такие концентрации антибиотиков, подавляя рост большинства видов посторонней микрофлоры, не угнетали рост музейных штаммов возбудителя мелиоидоза.
В качестве обогатительных применяют жидкую среду Левина или среду МакКонки. Chambon L. (1955) показал, что при посеве проб воды и почвы, взятых в эндемичных районах, в жидкую среду Левина с пересевом после 48 ч инкубации при 37°С на плотную среду Левина возбудитель удается выделять чаще, чем при прямом посеве этих проб на оптимальную среду. При посеве материала на среду МакКонки (Farkas-Himsley H, 1968) к ней добавляют 20 мкг/мл колимицина. В этих случаях большинство сопутствующих грамотрицательных бактерий не растет. Однако при больших посевных дозах и на этой среде может обильно расти целый ряд микроорганизмов. С целью идентификации бактерий, выросших на среде МакКонки с ко-лимицином, предложено использовать оксидазный тест, а для оксидазоположительных видовферментацию сахарозы и маннозы на среде Кинга и выращивание на дезоксихолат-цит-ратном агаре.
Ряпис Л. А., Ширяев Д. Т. (1974) в качестве селективной предложили плотную синтетическую среду, основой которой служит 2% забуференный агар с 0,025% сульфата магния и 0,1% сульфита натрия, к которой добавляется (3-аланин до конечной концентрации 0,03 М. На этой среде при посеве чистых культур многих видов микроорганизмов наблюдался рост лишь возбудителей сапа и мелиоидоза, а также синегнойной палочки, но при добавлении 25 мкг/мл неомицина прекращался также рост всех штаммов возбудителя сапа.

64
3 3-235
65

3*
Разработаны и другие селективные среды для выделения возбудителя мелиоидоза (Ashdown D., 1979; Galimandi M., Dodin A., 1983) успешно апробированные в экспериментах и эндемических регионах Юго-Восточной Азии, Австралии, Ирана, Франции.
Показана возможность использования для этих целей стандартных диагностических сред: кровяного агара; агара МакКон-ки; цистин-лактозного агара, дефицитного по содержанию электролитов (Walsh A., Wuthiekanun V., 1996).
Поповцева Л. Д. (1982) дает характеристику питательным средам, применяемым для выделения и идентификации возбудителя мелиоидоза, и предлагает оптимальную схему.
Фарбер С. М. и соавт. (1977) при получении сферопластов из возбудителей сапа и мелиоидоза и выделении из них мембранных структур использовали МПА с 5% глицерина. На этой же среде Денисов И. И. и соавт. (1995) выращивали Ps. pseudomallei СВБДО-141.
По данным Leelarasamee A., Bovornkitti S. (1989) рост оксида-зоположительных Ps. pseudomallei отмечается только на питательном агаре и на среде с минеральными солями.
Плеханова Н. Г. и соавт. (1992) разработали среду (ФГК бульон), обеспечивающую наиболее высокий уровень продукции экзопротеаз при поверхностном культивировании Ps. pseudomallei. При этом индекс протеолиза составил 4,0; тогда как на среде Лурия3,6; а на МПБ2,0. Среда состояла из ферментативного гидролизата казеина (1,5%), экстракта кормовых дрожжей (0,5%), минеральных солей (хлорида натрия, солей железа и магния), рН 6,9 и оказалась наиболее эффективной из 12 изученных, не содержала импортных ингредиентов. Для глубинного культивирования использовали среду, содержащую гидроли-заты казеина, гороха, черного альбумина и минеральные соли (Плеханова Н. Г., 1994).
Степин А. А. и соавт. (1992) отмечают снижение продукции микробных клеток и протеолитической активности экзопротеаз возбудителя мелиоидоза в анаэробных условиях. Активная аэрация среды увеличивала выход бактериальной массы на 50%, а протеолитической активностина 30%.
Коллектив под руководством Самыгина В. М. (1994) усовершенствовал питательную среду на основе гидролизатов казеина для культивирования возбудителей сапа и мелиоидоза.
Ps. mallei растет на МПГА в виде полупрозрачных серовато-белых колоний с перламутровым отливом, сливающихся в сплошной налет; на МПГБ и синтетической питательной среде (Евглевский А. А., 1973) образует муть, пристеночное кольцо, пленку и осадок, поднимающийся со дна пробирки штопором при встряхивании. На картофельной среде Павловского дает рост блестящих гладких колоний цвета меда, также сливающихся и темнеющих со временем. Посев культуры на обезжиренное
66
молоко вызывает его свертывание без пептонизации на 1014 сут. Посев производственного штамма на среду Гисса с набором Сахаров не изменяет окраски среды и не вызывает образования газа, тогда как некоторые другие штаммы расщепляют глюкозу и лактозу (цит. по Буковой Н. К., 1996). Ввиду высокой, в сравнении с другими микроорганизмами, чувствительностью к антимикробным препаратам, до настоящего времени не разработано для Ps. mallei достаточно эффективной селективной среды. Используемые, тем не менее, для подавления роста посторонней микрофлоры красители и антибиотики при прямом посеве исследуемого материала задерживают и без того недостаточно активный рост возбудителя сапа.
В последние годы все чаще в патологическом материале больных стали встречаться Ps. cepaciaбактерии с весьма широким спектром питания, включающим бензилпенициллин. Особую угрозу они представляют при кистозном фиброзе, вызывая более тяжелые осложнения и больший процент летальных исходов, чем Ps. aeruginosa (Prince A., 1986).
На основе окислительно-ферментативной среды с добавками лактозы, бацитрацина и полимиксина В разработана агаризован-ная селективно-диагностическая среда OFPBL для выделения Ps. cepacia от больных кистозным фиброзом. Ps. cepacia росли в виде желтых колоний на фоне зеленовато-желтой среды за счет разложения лактозы и даже сильные щелочеобразователи из р. Proteus при росте в ассоциациях с Ps. cepacia не влияли на окраску колоний последних. На этой среде процент выделения Ps. cepacia был в 23 раза выше, чем на других (Muszynski M. et al., 1986; Welch D.etal, 1987).
Carson L. et al. (1986) сравнивали рост Ps. cepacia, выделенных от больных кистозным фиброзом и из других источников, на селективных средахPCG, OFPBL, ТВ-Т, ацетамидной среде и агаре МакКонки. По сравнению с кровяным агаром (контрольная среда) лучшими ростовыми свойствами обладали PCG (93,4% выросших КОЕ) и OFPBL (84,4%), худшимиацетамид-ный агар (62,7%). На среде МакКонки росли 8,1% шт. Ps. cepacia от больных кистозным фиброзом, 46,8% шт. Ps. cepacia от больных другими патологиями и 84,1% шт. Ps. cepacia из окружающей среды.
Евдокимова Н. В. и соавт. (1994) изучали Ps. fluorescens в процессе азотного голодания, выращивая на синтетической среде следующего состава (мг/л): глюкоза20006000; KNO>3000 6000; КНРОа-ЮОО; КНРО^-Ю; NaCl-1000; MgS04-7H20-200; СаСЬ-2Н2О-40; KI-0,1; FeCb.6HiO-0,4; MnS04 4НЮ-0,4; Na2Mo04 2№О-0,2; ZnSO* 7Н>О-0,4; H.BO,-0,5 и ЭДТА-Na-5,0.
Подольская В. И. и соавт. (1994) использовали при изучении разложения цианидного комплекса серебра культурой Ps. fluorescens синтетическую питательную среду следующего состава
67
(г/л): КН2РО4-2; K2HPO4-I; Na2CO3.10H2O-0,5; MgSO4-0,3; NaCl0,1; пептон0,5; глюкоза2.
Селективные среды для выделения Ps. putida на сегодняшний день фактически не разработаны. Максимова Н. П. и со-авт. (1994) для характеристики флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, продуцируемого бактериями Ps. putida, выращивали их в питательном бульоне, среде Кинга В (King Е. et al., 1954), либо минимальной или агаризованной среде М 9 (Миллер Дж., 1976), которую перед автоклавированием обрабатывали 8-оксихинолином для выделения ионов железа (Meyer J. et al., 1978).
Седина С. А. (1992) исследовал влияние NaCl и метанола на рост культуры Ps. putida BS-2, утилизирующей диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода. Зависимости удельной скорости роста на среде с диэтиленгликолем от наличия в ней NaCl и метанола в диапазоне концентраций 04% и 020 г/л, соответственно, подчинялись уравнению неконкурентного торможения. При концентрации NaCl более 4% отмечено полное разобщение процессов конструктивного и энергетического метаболизма.
Кулаев И. С. и соавт. (1987) изучали условия культивирования Ps. lytica, обеспечивающие максимальное накопление в культуральном фильтрате фермента, обладающего бактериоли-тической активностью в отношении ряда грамположительных микробов. Показана возможность синтеза фермента лишь при введении в среду органических источников азота-пептона и триптона. Значительно повышался уровень его синтеза при добавлении в среду убитых клеток St. aureus в дозах от 0,5 до 2,5 мг/мл среды. Мальтоза, сахароза, галактоза, глюкоза и N-ацетилглюкозамин при концентрациях 0,1% в 510 раз снижали синтез фермента, но стимулировали накопление биомассы Ps. lytica. Делается вывод о регуляции биосинтеза фермента по механизму катаболитной репрессии. Отмечено отрицательное влияние на синтез фермента некоторых солей в концентрациях, используемых обычно для приготовления питательных сред.
Будченко А. А., Викторов Д. В. (1992) анализировали белковый спектр Ps. pseudomallei, Ps. cepacia и Ps. aeruginosa при выращивании на различных средах. Анализ пептидограмм культур Ps. pseudomallei показал наибольшее количество фракций в спектре (следовательно более широкий диапазон синтеза пептидов) на минимальной среде Gilardi, меньшеена F-arape и TSab и минимумна питательном агаре. Спектры Ps. cepacia и Ps. aeruginosa в гораздо меньшей степени зависели от вида среды.
Жога Л. К. и соавт. (1995) при конструировании транспортной среды для патогенных псевдомонад в качестве консерванта использовали глицерин, ингибиторовантибиотики и красите-
ли. В состав среды входил также гидролизин, представляющий собой кислотный гидролизат крови КРС. Небольшое количество его (0,05%) обеспечивало, однако, питание и сохранение искомых псевдомонад. Ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры не влияли на возбудителей сапа и мелиоидоза, устойчивых к ампициллину (MIC 250500 мкг/мл), полимиксину (1000 мкг/мл) и генциановому фиолетовому. Состав (г/л): глицерин 200; гидролизин0,05; NaCl5; ампициллин0,01; полимик-син0,0025; генциановый фиолетовый0,0025.
Рожавин М. А., Бугаева Е. И. (1986) представили краткий, но емкий обзор литературы по использованию селективных агентов для выделения Ps. aeruginosa, анализируя их достоинства и недостатки. Это, помимо описанных выше ацетамида, цетримида N-ЦПХ, N-ЦПХ с фенозаном, этония с пенициллином, пропани-да, бриллиантового зеленого, иргазана, также кристаллический фиолетовый с нейтральным красным (Daly J. et al., 1984), кристаллический фиолетовый с телозином и канамицином (Mossel D. et al., 1976), производные 5-нитрофурана-фурациллин, фура-гин, фурадонин (Ароне Р. М., Чурсина Т. В., 1976; Mossel D. et al., 1976; Negretti E, Trabattoni C, 1984), пенициллин с новобиоци-ном с С-390 (Sands D., Rovira A, 1970), С-390 (Marold L. et al., 1981; Araj G., 1984; Robin Т., Janda M., 1984). При использовании индикаторной среды Daly J. et al. (1984) оказалось возможным в первые 24 ч. идентифицировать 97% клинических изолятоввоз-будителя синегнойной инфекции.
Вульфдитер Ш., Петер К. (1992) предлагают для получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы культивировать соответствующие микроорганизмы-продуценты из рода Pseudomonas (Ps. putida) на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода DL-лейцин, DL-лизин, DL-карнитин, алифатические углеводороды с длиной цепи С6-С10, а также источники азота и минеральные соли сульфат магния, фосфат натрия двузамещенный, фосфат калия однозамещенный, соединения железа и хлора. При этом себестоимость конечного продукта снижается.
Марцинкявичене Л. Ю. и соавт. (1991) предлагают с целью повышения активности и чистоты холестеринэстеразы культивирование его продуцента Ps. mendocina ВКПМ В-2173 на питательной среде, содержащей (г/л): в качестве источника углерода лактозу 15; индуктора-соевую муку 2040; а также двузамещенный фосфат калия 0,52,5; семиводный сульфат магния 0,50,8; хлорид калия 0,30,8; нитрат натрия 13; говяжий жир 38 и воду.
Завалова Л. Л. и соавт. (1992) сравнивали дестабилазную и пептидазную активности экстрактов Ps. hirudinis, выращенных на различных питательных средах (LB, NB, ВН и синтетические). Отобраны условия культивирования в больших (до 2 кг биомассы) объемах на В и БВК-средах. Сравнительный анализ

68
69
бактериальных экстрактов выявил в обоих случаях одинаковый уровень дестабилазной и значительно более высокий уровень суммарной пептидазной активности для БВК-экстрактов.
Бойков Ю. Н. и соавт. (1991) предлагают для повышения выхода фермента и его активности при культивировании Ps. stutzeri ВКПМ В-4724-продуцента рестриктазы Psu 1, использовать питательную среду, содержащую (г/л) в качестве источника амин-ного азота панкреатический почечный гидролизат 1520; а в качестве минеральных солей-сульфат аммония 12; цитрат натрия 0,50,7 и хлорид железа 0,001-0,002.
Бурдь В. Н. и соавт. (1994) перед клонированием гена бром-пероксидазы из Ps. aureofaciens культивировали клетки в среде, содержащей (г/л): бактотриптон10; дрожжевой экстракт5; хлорид натрия5; добавляя при выращивании на чашках Петри 1% агара.
Pierce L., Schroth M. (1994) разработали простую процедуру определения колоний Pseudomonas, которые аккумулируют poly-betahydroxybutyrate (PHB), продукт накопления, характеризующий многие нефлуоресцирующие псевдомонады на среде с нильским голубым. Колонии РНВ-положительных бактерий флуоресцировали от ярко оранжевого до желтого цвета под длинноволновым ультрафиолетовым с когда вырастали на среде, содержащей РНВ и краситель нильский голубой. Яркие оранжевые флуоресцирующие гранулы были видны внутри клеток, когда рассматривались микроскопически под ультрафиолетовым освещением. Колонии флуоресцирующиех псевдомонад не флуоресцировали на этой среде, флуоресцирующие гранулы не были видимы микроскопически. Эта методика позволяет обнаруживать РНВ-положительные псевдомонады без микроскопического исследования. Среда с нильским голубым также была полезна как дифференциальная изолирующая для Pseudomonas solanacearam и может быть для других нефлуоресцирующих псевдомонад.
Упомянутая выше среда Кинга А в дальнейшем была модифицирована. Meed G., Adams В. (1977) показали, что уменьшение содержания цетримида до 10 мкг/мл позволяет расти всем пигментированным и непигментированным психрофильным псевдомонадам. Для увеличения его селективного действия они добавили 50 мкг/мл цефалоридина и 10 мкг/мл фуцидина. В результате была разработана селективная для псевдомонад среда CFC (Cephaloridine-Fucidin-Cetrimide).
Stanbridge L., Board R. (1994) использовали модифицированную среду CFC для дифференциации мясных псевдомонад и эн-теробактерий. Некоторые виды семейства Enterobacteriaceae развивающиеся на кусках говядины, упакованных в регулируемой атмосфере, могут расти на среде CFC. Добавление 1% аргинина и 0,002% индикаторы рН фенолового красного в эту српду позволяло дифференцировать две группы. Псевдомонады продуцировали аммиак из аргинина, в то время как энтеробактерии вообще
не использовали этот субстрат. Смещение рН в щелочную сторону внутри и вокруг колоний псевдомонад вызывало розовое окрашивание с феноловым красным.
Azad H., Cooksey D. (1995) разработали среду oleander knot agar (OKA) для изоляции Ps. savastanoi из растений олеандра. Среда ОКА содержала (г/л) агара 14,0; L-серина 2.0; дрожжевого экстракта 1,0; NH4*HiPO4-0,5; lGHPO4*3H2O-0,5; NaCl-5,0; MgS04*7H200,2; борной кислоты 1,0; ванкомицина0,15; цефа-лексина0,05; бацитрацина 0,05; ампициллина 0,015; новобио-цина 0,02 и циклогексимида 100. Все 39 штаммов Ps. savastanoi из различных географических областей росли на среде ОКА и количественный выход составлял от 5,7 до 93,6% (в среднем =43.6%). Среда ОКА была селективнее чем другие исследованные среды, включая BCBRVB, M-71, KBBC, MSP, пролиновый агар и PVF-1, и ингибировала от 89 до 96,7% сапрофитных бактериальных штаммов, выделяемых из тканей олеандра. 44% других исследованных бактерий, патогенных для растений, не росли на среде ОКА, а 13% росли скудно. Среда ОКА использовалась для обнаружения эпифитных популяций Ps. savastanoi из галлов, листьев, стволов и цветов, а также для обнаружения системного движения бактерии в стволах олеандра. Патоген был представлен в промывной воде от 26 из 34 предположительно здоровых растений олеандра. 31 из этих растений впоследствии вырабатывали галлы в течение 1 года. Бактерия была также способна к системному движению на 25 см выше и 20 см ниже места инокуляции.
Jeppesen С. (1995) предложил несколько сред, особенно для обнаружения Aeromonas spp., но также для Plesiomonas shigel-loides и Pseudomonas spp. Некоторые из них были предназначены для общих целей, а другиеспециально для исследования образцов клинических, окружающей среды и пищевых. Все среды являлись селективными из-за наличия антибиотиков, желчных солей, красителей и других, аналогичных по действию, агентов, а также дифференциальными, что было основано прежде всего на способности микроорганизмов ферментировать или не ферментировать углеводы. Как со всеми селективными средами, выход стрессированных клеток иногда предотвращался и конкурирующая флора не всегда полностью ингибировалась так, чтобы необходимы были подтверждающие тесты на предполагаемые положительные колонии. Выбор специфической среды для изоляции Aeromonas spp. будет всегда зависеть от типа рассматриваемого образца или нужды исследователя в качественном обнаружении или количественном выходе. Самым лучшим для количественной оценки Aeromonas spp. из образцов продовольствия и окружающей среды оказался крахмал-ампициллиновый агар (starch ampicillin agarSAA), хотя можно было бы рекомендовать и другие. Имеется потребность в сравнительном анализе, включая агар Rippey Cabelli (mA), ампициллин-желчные соли-инозитол-ксилозный агар (ampicillin bile salts inositol xylose-MIX agar), ам-

70
71
пициллин-декстриновый агар (ampicillin dextrin agarADA), декстрин-фуксин-сульфитный агар (dextrin fucSsin sulpSite agar DFS) и крахмал-глутамат-ампициллин-пенициллин-С-глюкоз-ный агар (starch glutamate ampicillin penicillin C-glucose agar SGAP-10C) в дополнении к SAA. Для рутинного анализа образцов окружающей среды и продовольствия на присутствие P. shigelloides, рекомендуется расширенный посев на инозитол-бриллиантовый зеленый-желчные соли (inositol brilliant green bile saltsIBB) и plesiomonas (PL) агары. Для Pseudomonas spp. агар CFC позволяет количественный выход как пигментированных, так и непигментированых штаммов из образцов продовольствия и окружающей среды, в то же самое время ингибируя большинство других организмов.
Szita G. et al. (1995) разработали синтетическую среду (Z-агар) для селективной изоляции Ps. aeruginosa из пищевых продуктов. Синтетическая средакак источник азота и углерода содержит ацетамид, при разложении которого на аммиак и уксусную килоту Ps. aeruginosa продуцирует для себя необходимые питательные вещества для роста. Среда не содержит ингибиторов. Селективность ее была проверена инокуляцией чистых культур различных микробов, принадлежащих к группам Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Bacillus и Staphylococcus. Полноценность синтетической среды была также проверена общенациональным тестированием с использованием двух образцов молока, содержащих 103/мл (образец молока I) и 105/мл (образец молока II) Ps. aeruginosa. Обнаружено, что селективность синтетической среды была лучше чем цетримидного агара (Cetrimide-agar) предписанного Венгерским стандартом. Общепринятым национальным тестом не выявлено значительных различий между результатами, полученными на цетримидном и Z-arapax в случае образца молока, содержащего 105/мл Ps. aeruginosa. Однако в молоке, содержащем 103/мл Ps. aeruginosa, значительные различия обнаруживались в пользу Z-arapa. Результаты были сопоставимы и воспризводимы на обоих средах. Новая среда запатентована, производится и продается фирмой «REANAL Fine Chemicals» (Венгрия).
Gould W. et. al. (1985) предложили для выделения флуоресцирующих псевдомонад среды Si и Si, содержащие детергент на-трийлаурилсаркозин и триметоприм.
2.2. Сем. Нейссерии
Известная среда для выделения патогенных нейссерии, содержащая питательную основу, сыворотку крови, агар-агар и воду (Лабинская А. С, 1972), не обеспечивает высоких ростовых свойств (Гаджиева А. Г. и соавт., 1982). Последние авторы для этих целей дополнительно вводят в среду аммониевую соль
5,5 дибром-о-крезолсульфофталеина, а в качестве питательной основы используют казеиново-дрожжевой гидролизат.
West S. et al. (1985) изучали потребление железа патогенными нейссериями (N. gonorrhoeae и N. meningitidis) и по результатам опытов высказали предположение, что экспрессированные у же-лезодефицитных мутантов белки наружной мембраны могут являться рецепторами трансферрина и лактоферрина.
Усвяцов Б. Я. и соавт. (1987) разработали метод предварительного накопления патогенных нейссерии в среде 199 или Игла для повышения частоты их обнаружения при высеве материала на плотные селективные питательные среды.
Hodge D. et al. (1987) выделили вагинальный штамм нейссерии, морфологически и биохимически похожий на менингококк, но серологически на гонококк. Так, при культивировании его на средах без цистеина морфология колоний была типична для N. meningitidis. Это грамотрицательный диплококк, оксида-зо- и каталазоположителен, не расщепляет сахарозу, фруктозу, лактозу и маннит, не обладает p-D-галактозидазной, ДНК-азной и трибутиразной активностью, устойчив к спектиномицину.
Stoakes L. et al. (1987) предложили среду для идентификации в течение 24 ч различных видов p. Neisseria и Branchamella по способности сбраживать сахара. Для приготовления ее основы к 600 мл воды прибавляли 6 г агара Noble, 9 г протеозного пептона № 3 («Difco»), 3 г NaCl и 7 мл индикатора Andrade. После полного растворения ингредиентов доводили рН до 8,1 и стерилизовали 15 мин при 121°С. К каждым 200 мл основы, охлажденной до 56°С прибавляли по 2 г углевода (декстрозы, мальтозы, сахарозы) и стерилизовали. После этого к каждым 20 мл добавляли по 3 мл суплекса, растворенного в 10 мл дистиллированной воды. Конечное значение рН среды7,2. Сахаролитическую активность определяли по изменению цвета среды на розовый (в незасеянном виде она бесцветна). С ее помощью удалось в течение 24 ч идентифицировать 99,1% нейссерии 9 видов, тогда как на триптиказо-цистиновом агаревсего 93,7%.
Robinson В., Palma В. (1986) сравнивали методы идентификации Neisseria с помощью коммерческих систем Gonocheck II фирмы «Du Pont» и RIM-N фирмы «Austin Biological» и традиционные культуральные методы с использованием агара с цис-тином и Kellogg-arapa. Ошибки при идентификации N. gonorrhoeae в основном были обусловлены ложноположительными результатами при определении ферментации глюкозы. Эффективность использованных культуральных методов была соответственно равна 67 и 100%, а методов с использованием коммерческих систем99%. Ошибки при идентификации N. meningitidis имели место лишь при использовании Kellogg-arapa, эффективность культуральных методов при этом составляла, соответственно, 100 и 93,5%. Эффективность методов с использованием коммерческих систем равнялась 100%. На осно-

72
73
воротка, а также длительность культивирования. Выращивание осуществляли на плотных и жидких средах. В качестве плотных использовали тиамин-цистин-глутаминовый агарТЦГА (Гад-жиева А. Г., 1975), содержавший 20% сыворотки крови, 1,5% агар на гидролизате мяса по Хоттингеру; среду «25-й вариант» (Мохов Ю. В., 1983); безбелковую среду с казаминовыми кислотами следующего состава: агар «Difco»25 г/л, глюкоза7 г/л, NaCl 10 г/л, казаминовые кислоты17,5 г/л, глутаминовая кислота 170 мг/л, крахмальная паста0,2 л/л, 20%-ый раствор NaOH 2,75 мл/л. Жидкими средами являлись модифицированная Коэ-на-Уиллера (Фаньковская Э. К. и соавт., 1969) и синтетическая, состоявшая из набора солей и аминокислот. Показана зависимость интенсивности микрокапсулообразования от концентрации в среде глюкозы. При содержании ее 7 г/л и более формирование микрокапсулы угнеталось. При этом, вероятно, образование микрокапсулы зависело от глубины расщепления в питательной среде крупных белковых молекул. Формирование микрокапсулы не зависело от содержания в среде аминного азота в изученных концентрациях (от 49 до 160 мг%). Наиболее интенсивно микрокапсулы образовывались в синтетической среде и на ТЦГА с 20% сыворотки, прогретой в течение 1 ч при 56°С, причем формирование поверхностных структур зависело от типа среды. На средах, содержавших сывороточные белки, на поверхности микробов, помимо истинной микрокапсулы, формировалась псевдокапсула. Площадь среза ее увеличивалась с повышением концентрации (0 20%) сыворотки крови в среде, тогда как на формирование микрокапсулы этот показатель не влиял. Добавление в безбелковую среду Коэна-Уиллера ионов Fe3+ от 0 до 32 мг/л не сказывалось на интенсивности формирования микрокапсулы и росте биомассы.
Вальвачевым Н. И. и соавт. (1984) подготовлены методические рекомендации, где представлено 9 рецептур сред для выделения и идентификации менингококков, рекомендуемых в соответствии с приказом МЗ СССР № 98 от 29.01.81 «О расширении функций Всесоюзного центра менингококковой инфекции».
Морозова Т. В. и соавт. (1998) предлагают для выделения и культивирования менингококов менингоагар, содержащий в качестве белковой основы панкреатичекий гидролизат казеина, ав-толизат дрожжевой, ферментативный гидролизат черного амбу-лина (стимулятор роста гемофильных микроорганизмов), а также глюкозу, хлорид натрия и агар-агар.
Jessouroun E. et al. (1995) сравнили экспрессию железорегули-руемого белка наружной мембраны N. meningitidis на триптиче-ском соевом бульоне и синтетических средах: Frantz и неполной Catlin. Хотя экспрессия железорегулируемого белка на первых двух средах не различалась, при получении этих белков для вакцины предпочтительна среда Frantz, имеющая известный состав.
2.3. Род Бордетеллы
Род Bordetella входит в семейство Halobacteriaceae и включает три вида: Bord. pertussis, Bord. parapertussis и Bord. bronchisep-tica.
Wright P. (1991) подчеркивает особенности распространения коклюша в развивающихся странах, связанные с несвоевременной его диагностикой вследствие трудностей культивирования Bord. pertussis.
Для количественных процедур при выявлении и изоляции Bord. pertussis из клинических образцов используется агаровая основа Борде-Жангу (Bordet-Gengou), предложенная еще в 1906 году. Среда превращается в селективную при добавлении мети-циллина. Kendrick, Eldering (1934) заменили 50% человеческой или кроличьей крови, рекомендованной в оригинальной прописи, на 15% овечьей, с целью сделать среду более практичной для лаборатории. Кровяной агар Борде-Жангу представляет собой обогащенную казеиновым пептоном среду с добавлением картофеля и глицерина, являющихся источниками питания Bord. pertussis. Дефибринированная овечья кровь также обеспечивает питание и, кроме того, позволяет детекцию гемолитических реакций с целью идентификации данного микроорганизма.
Гладкие формы Bord. pertussis на среде Борде-Жангу образуют колонии блестящие, жемчужно-серого цвета, выпуклые, с диаметром 0,251 мм. Они не растут на шоколадном, кровяном, асцитном агарах и среде Лефлера; индол в пептонной воде не образуют, углеводы не ферментируют. Колонии промежуточных форм не отличимы от гладких, но на среде Борде-Жангу отмечается гемолиз. Они хорошо растут на кровяном и шоколадном агарах, средах Филдса, Лефлера и МПБ. Шероховатые формы, появляющиеся только при культивировании в лабораторных условиях, растут на всех средах. На среде Борде-Жангу гемолиз отсутствует, колонии сухие, зернистые, непрозрачные, коричневого цвета (Захарова М. С, Кирьянова Г. П., 1980).
Bord. pertussis не нуждаются для роста в СО:, но некоторые исследователи используют при выращивании 510% СОз. При культивировании на угольном агаре к нему добавляют 10% де-фибринированной лошадиной или овечьей крови. В бактериологических лабораториях развивающихся стран часто более доступна кровь человека. По вышеперечисленным причинам Норре J.. Schlagenhauf M. (1989) изучали влияние типа добавляемой к угольному агару лошадиной, овечьей и человеческой крови при выращивании Bord. pertussis в атмосфере СО: по сравнению с обычной воздушной атмосферой. В качестве антибиотика использовали 40 мкг/мл цефалексина. Показано, что в присутствии СО: среднее число колоний ниже, чем при воздушной аэрации. То же отмечается и на средах с антибиотиками. Присутствие человеческой крови снижает рост на угольном

S6
S7
агаре, но при отсутствии лошадиной или овечьей ее можно использовать.
Норре J. (1986, 1988, 1989) в кратких обзорах рассматривает плотные и жидкие среды для выделения, культивирования и транспортировки Bord. pertussis, а также селективные агенты-ин гибиторы микрофлоры носоглотки. Регламентируются пита тельные среды и их составные части производства разных фирм. В качестве транспортной среды предлагается угольный (или аль- гинатный) агар с кровью. "
HoppeJ., SchwadererJ. (1989) исследовали эффективность роста Bord. pertussis на 4 агаровых средах: на среде для выделения легионелл с 3 мкг/мл линкомицина; на шоколадно-кровяном агаре (с лошадиной кровью) с 40 мкг/мл цефалексина; на шоко-ладно-кровяном агаре с 3 мкг/мл линкомицина и на шоколадном агаре с 3 мкг/мл линкомицина. Значения скорости роста бактерий и числа колоний были наиболее высокими на шоколадно-кровяном агаре с цефалексином. На нем во всех экспериментах был получен 100% рост, а фаренгиальная флора почти полностью подавлялась.
Для приготовления корпускулярной коклюшной вакцины Bord. pertussis обычно культивируют в синтетической жидкой среде SS, разработанной Stainer, Scholte (Стейнер-Шолт). Поскольку рост культуры и продукция коклюшного токсина повышаются при добавлении в среду SS 2-6-0-диметил-р-циклодекст-рина, Wirsing von К. et al. (1988) использовали среду, обогащенную этим соединением для выделения Bord. pertussis из клинического материала, полученного из мазков у детей и взрослых. Установлена возможность культивирования на этой среде штаммов Bord. pertussis, которые не росли на угольном агаре.
Chan F. et al. (1987) изучали ингибирующее для Bord. pertussis влияние различных концентраций антибиотиков на кровяном угольном агаре, приготовленном из сухого угольного агара («Ох-oid») с цефалексином и среде Борде-Жангу. На первой росли все изученные штаммы (очевидно из-за наличия в ней угольного компонента), а на среде Борде-Жангутолько 20,2%. Показано сходство аминокислотного состава изученных сред.
Норре J., Vogl R. (1986) показали превосходство культивирования Bord. pertussis на угольном агаре («Oxoid»), содержащем 10% дефибринированной лошадиной крови с добавлением и без 40 мг/л цефалексина, в сравнении со средой Борде-Жангу с добавлением 20% дефибринированной крови овец и 40 мг/л цефалексина, а также модифицированной среды Jones-Kendrick (по скорости роста, количеству выросших штаммов и качеству колоний. Отмечается также свойство всех штаммов Bord. pertussis сохранять жизнеспособность при 28°С в течение 3 недель. Для выделения авторы предлагают угольный агар с кровью лошади и цефалексином. Угольный или альгинатный агар с лошадиной кровью и цефалексином оказался более эффектив-
ной транспортной системой, чем агар Jones-Kendrick и среда Amies.
Мерцалова Н. У. и соавт. (1987) отмечают зависимость фено-типической выраженности адгезивных свойств Bord. pertussis от питательных сред.
При выращивании коклюшного микроба в промышленных количествах (для производства токсина, необходимого при конструировании бесклеточных вакцин) используются, как правило, полусинтетические или полностью синтетические среды (Ап-dron N. et al., 1988). Семина И. Э. и соавт. (1995) изучили влияние подобных сред на уровень синтеза аденилатциклазы коклюшного микроба.
Норре J. et al. (1988) выявили низкую эффективность дополнительного к угольно-кровяному агару с цефалексином использования аналогичного бульона с 40 мг/л цефалексина для выделения Bord. pertussis.
Бакулина Н. А. и соавт. (1980) показали, что наибольшее накопление бактериоцинов Bord. pertussis при культивировании на жидких средах наблюдается при использовании среды типа Коэ-на-Уиллера с добавлением 0,1% твина-80 и на бульоне Хоттинге-ра с 1 % глюкозы.
По данным Wardlow A. et al. (1976) концентрация магния в среде выращивания влияет на синтез белковых компонентов коклюшного микроба, обладающих протективной и гистаминсен-сибилизирующей активностями.
Morrill W. et al. (1987) выделяли Bord. pertussis из назофарин-геальных мазков, хранящихся в транспортной среде Регана-Леве (Regan-Lowe), используя агары Регана-Леве, Борде-Жангу и с циклодекстрином (CD). Количество жизнеспособных Bord. pertussis, выделенных на агарах Борде-Жангу и CD, составило, соответственно, 90% и менее 70%, выделенных на агаре Регана-Леве.
Шмелева Е. И. и соавт. (1987) изучали кинетику размножения различных штаммов Bord. pertussis в условиях периодического культивирования в шуттелируемых емкостях и в сосудах с принудительной аэрацией 6 синтетических и полусинтетических малокомпонентных питательных сред определенного химического состава.
Смирнов В. Д., Сюндюкова Р. А. (1987) оптимизировали условия выращивания коклюшных бактерий для получения их эк-зоантигеновгемагглютинина и токсина, являющихся основными компонентами при получении бесклеточной коклюшной вакцины. Культивирование осуществляли в синтетических и полусинтетических питательных средах. В качестве стимулятора токсинообразования использовали 2-6-0-диметил-Р-ииклодек-стрин, оптимальная концентрация (0,055 мг/л) которого позволяет повысить уровень коклюшного токсина до 1030 мг/л без существенного изменения динамики его образования.

88
84
Chazono M. et al. (1992) предлагают культивировать Bord. pertussis в присутствии целлюлозы и ее дериватов с целью получения одновременно больших количеств коклюшного токсина и филаментозного гемагглютинина для приготовления вакцины.
Необходимым условием успешного проведения экспериментов по конструированию рекомбинантной противококлюш-ной вакцины является стандартность и высокое качество питательных сред. За рубежом для культивирования Bord. pertussis разработаны специальные среды, в частности уже упоминавшиеся среды Борде-Жангу, Коэна-Уиллера, Стейнера-Шолта. По экономическим причинам российские исследователи используют в работе среду КУА, имеющую, по исследованиям Степан-шиной В. Н. и соавт. (1994), низкие ростовые свойства и который непригоден для генно-инженерных работ. Авторы на модели КУА создали плотную питательную среду с белковыми основами, разработанными в ГосНИИ прикл. микробиологии (Оболенск): серно-, солянокислотными и панкреатическим гидролизатами казеина и рыбной муки с сохранением других компонентов. Эффективность перечисленных гидролизатов была сравнима с гидролизатом казеина фирмы «Difco».
Алексеева Л. Н. и соавт. (1998) разработали сухую среду для выделения Bord. pertussis, содержащую солянокислотный гидро-лизат казеина, дрожжевой экстракт, агар-агар, хлорид и карбонат натрия, крахмал, активированный уголь, амилопектин и обеспечивающую интенсивный рост данного микроорганизма.
Halperin S. et al. (1992) использовали .тля выделения Bord. pertussis фосфатный буфер с гидролизатом казеина.
Ваксман А. Н., Шильман С. Д. (1967) рассматривают методические вопросы использования картофельно-глицеринового, молочно-кровяного и казеиново-угольного агаров для выделения коклюшного и паракоклюшного микробов.
Kurzynski Т. et al. (1988) установили примерно одинаковую эффективность модифицированных сред Борде-Жангу и агара Регана-Леве с цефалексином и анизамицином для выделения коклюшных и паракоклюшных микробов из клинического материала (назофаренгиальных тампонов). Максимальная чувствительность анализа достигалась при параллельном культивировании в обеих средах.
Gorringe A. et al. (1991) установили, что дефицит железа в ростовой среде приводит к появлению у Bord. pertussis и Bord. parapertussis новых мембранных белков, а также сидерофоров. Последние обеспечивали перенос ионов железа с трансферрина бактериальным клеткам.
Farrington (1977) использовал агар МакКонки, содержавший фуралтадон и нистатин (среда G20), для изоляции бордетелл из носовых мазков.
По данным Smith I., Baskerville A. (1979) агар МакКонки и среда G20 показывают хорошие результаты при относительно
высокой численности бордетелл. Исследовались носовые мазки у молодых свиней. При использовании среды G20G, базирующейся на пептоннном агаре с добавлением пенициллина, фурал-тадона и гентамицина, бордетеллы изолировались у 50% свиней в возрасте 112 недель.
Quentin-Millet M.-J. et al. (1990) запатентовали питательную среду для бордетелл, содержащую циклодекстрин или соль дек-страна в сочетании с этерифицированным производным D-глю-козы с молекулярной массой не менее 2 кД.
Arp L. (1986) изучал влияние питательной среды на сцепление Bord. avium со слизистой трахеи.
При изучении клеточных жирных кислот Moore С. et al. (1987) выращивали Bord. avium и Bord. bronchiseptica на сердечно-мозговом агаре добавлением 5% бараньей крови в атмосфере 5% С02 16 ч при 37°С.
Fuzi M. (1975) рекомендует добавлять в среду для изоляции Bord. bronchiseptica нитрофурантин, к которому большинство грамотрицательных бактерий высокочувствительны.
Elias В., Galgoczi В. (1981) считают необходимым при изоляции Bord. broncSiseptica из носовых мазков у свиней вводить в агар МакКонки дополнительно пенициллин и нитрофурантин. Elias В. (1987) рекомендует при изготовлении вакцины против атрофического ринита и воспаления легких свиней, вызванного Bordetella и Pasteurella, культивировать бордетелы вначале на плотной, а затем в жидкой питательных средах.
Hommez J. et al. (1984) показали эффективность использования цефалексина в селективной среде для изоляции Bord. bronchiseptica из носовых мазков и посмертного материала, хотя лучшие результаты были получены при добавлении в среду пенициллина и фуралтадона.
Татаринцев Н. Т., Кожевников С. В. (1993) при диагностике пневмонии свиней бордетеллезной этиологии посевы образцов на Bord. bronchiseptica осуществляли на следующие обогащенные среды: КУА. среда Гартоха, агар МакКонки и кровяной агар.
Миланко А. Я. и соавт. (1996) использовали для первичной изоляции, помимо указанных сред, также агар МакКонки с 1% декстрозы, лактозно-сахарный агар и др.
Vidic В. et al. (1993) культивировали Bord. bronchiseptica на следующих плотных средах: агары кровяной; МакКонки, содержащий 1% декстрозы; Эндо; триптон-соевый; пептонный; Борде-Жангу. древесно-угольный и FC. Последний содержал 10 г/л пептона; 10 г/л лактозы; 10 г/л глюкозы; 3 г/л мясного экстракта; 1,5 г/л желчных солей; 5 г/л NaCl и 6,6 мл/л 0,2%-ого фенолового красного: рН-7,4. Была исследована чувствительность Bord. bronchiseptica к следующим антибиотикам и терапевтическим агентам: пенициллин, линкомицин, нитрофурантин, бифу-рал, цепорекс, стрептомицин, ампивет, спесийномицин. гриме -тозол, тилан, гентамицин, флубактин, тетрациклин, хлорамфе-

90
91
никол. Исходя из полученных результатов конструировались на базе перечисленных сред рецептуры с включением тех или иных антибиотиков и их комбинаций. Наилучшие результаты получены при использовании кровяного и FC-агаров, содержащих пенициллин с цепорексом или нитрофурантином (6869,4%). Другие среды и сочетания антимикробных препаратов также обладали удовлетворительной селективностью. Среди безингиби-торных сред агары МакКонки и Эндо были наиболее селективными.
Frohlich В. et al. (1995) показали, что ионный состав и общая ионная концентрация ростовой среды являются важными факторами лимитирования продуктивности в аэрируемых реакторах, используемых для продукции коклюшного токсина и других антигенов Bord. pertussis. Концентрация солей отрицательно влияла на клеточный рост дикого типа Bord. pertussis формирование специфического токсина. Концентрация ионов натрия ниже 140 мМ коррелировала со снижением преципитации в специфическом выходе коклюшного токсина и иначе-с выходом ростассоциированного продукта. Высокие концентрации соли в среде приводили к снижению конечных концентраций клеток, но не воздействовали на начальную скорость роста. Предполагалось, что новая среда позволит увеличить на 6070% выход как клеток, так и токсина благодаря замене хлорида натрия в цикло-декстриновой жидкой (cyclodextrin liquidCL) среде и дополнительно введенному мононатрия глутамату, который служит источником натрия, углерода и энергии.
2.4. Род Бруцеллы
Возбудители бруцеллеза имеют систему ассимиляции эритри-толаосновного источника углевода и энергии для бактерий данного вида (Румянцев С. Н., 1983). Бруцеллы относятся к аминоге-терогенным микроорганизмам, требующим для обеспечения роста наличия свободных аминокислот в качестве источника азота (Кондратьева О. В., 1968). Поскольку наиболее богаты по аминокислотному составу белки животного происхождения, до настоящего времени в практических лабораториях преимущественно используются питательные среды на их основе. Из субстратов животного происхождения чаще всего применяются мясо, печень, селезенка (Аверкиева Р. С, Ременцова М. М., 1968). В состав многих сред для культивирования бруцелл входит кровь, чаще сыворотка (Колесникова Н. С, 1961; Альтон Дж., Джонс Л., 1968).
Особый интерес с экономической точки зрения представляет применение тех компонентов крови, которые до сих пор не использовались или использовались не полностью. Грушина Т. А. и соавт. (1978) предлагают для выращивания бруцелл козье-
овечьего, свиного и, в меньшей степени, бычьего видов применять (3-глобулиновые среды на основе гидролизата (J-глобулино-вой фракции (отход производства у-глобулина) с аминным азотом 200250 мг%. Эти среды рекомендуются и для бактериологической диагностики бруцеллеза у людей, так как с их помощью выделяется в 2,4 раза больше гемокультур, чем на широко применяемой мясо-пептонной среде. Затраты при этом сокращаются на 53,8%. Предлагается также использование твина-40 и твина-60 для повышения ростовых качеств сред, поскольку установлена способность бруцелл разных видов их гидролизо-вать (Рыкова В. И., Домарадский И. В., 1963).
Другие авторы рекомендуют для повышения ростовых качеств сред, помимо твинов, заменяющих сыворотку крови животных, использовать глюкозу и глицерин. Предлагается также в качестве основы сред гидролизат из китобойной муки, отходов плацентарной и абортной крови, экстрактов куриного эмбриона и ворсинок плаценты (Смирнова В. И., 1960,1962; Мухарвер Р. В. и соавт., 1961; Бабушкин И. Н., 1964; Gardini G., Domini M., 1954; Williams A. et al., 1962). Ишанова Р. Ж. и соавт. (1978) показали возможность замены мясных настоев гидролизатами крови, печени, селезенки и плаценты крупного и мелкого рогатого скота.
Ускорению роста бруцелл способствует введение в среду, содержащую агар-агар, глюкозу, глицерин, хлорид натрия и воду, веществ, в которых присутствует аминный азот: неполных панкреатических гидролизатов казеина и придатков с семенниками, а также аминокислоты L-цистина (Бедарева 3. М. и соавт., 1983). Для ускорения адаптации свежевыделенных бруцелл в среду, содержащую питательный агар, глюкозу и глицерин, добавляют риванол (Резников Б. Ф., 1987).
Способность бруцелл дезаминировать серии выявили Бело-баб В. И. и соавт. (1969), Меринов С. П., Широков В. А. (1971). Позднее механизм деградации бруцеллами серина, треонина и некоторые свойства ферментов, участвующих в этом процессе, изучали Широков В. А., Меринов С. П. (1976).
Исходя из полученных ранее данных о питательных потребностях вакцинного штамма Br. abortus 82 (Хазипов Н. 3. и соавт., 1973; Корунов В. П., 1974), атакже анализа литературы по данному вопросу (Передереев Н. И., Журавель Е. Ш., 1968; Вершилова П. А, 1972), Корунов В. П. (1980) подобрал компоненты полусинтетической среды, содержащей гидролизат лактальбумина фабричного производства, 1% глюкозы и набор неорганических солей и витаминов: хлорид и фосфат натрия, гипосульфат, сульфат магния, железо, марганец, тиамин, никотиновую кислоту, пантотенат кальция. Сравнение с классическим печеночно-пеп-тонным бульоном (ППБ) физико-химических характеристик показало их сопоставимость, причем количество аминного азота-одного из основных показателей качества средыв полусинтети-

92
чз
PSST; HAE; BTBST; SS-VN; STA; НАЕВ; SPB; WBAYB; TBS; GSTB7.4 и GSTB8.5; а также STB.
В настоящее время в коммерческом варианте у нас в стране для культивирования и выделения вибрионов выпускаются агаровые среды Иркутским НИПЧИ (состоит из гидролизатов казеина и кормовых дрожжей, хлорида, фосфата и метабисульфита натрия, едкого натрия и агара) и НПО «Питательные среды» г. Махачкала (щелочной и МА-агары). Ассортимент сред зарубежных производителей, работающих на нашем рынке, гораздо шире. Это агары TCBS («Difco», «Sanofi», «Sinn»), SDS, Rippey-Gabelli («Himedia») и другие.
компонента не обеспечивали приемлемого роста пастерелл. Показана стимуляция дыхания и роста их некоторыми аминокислотами, например лейцином и тирозином, гидролизатом рыбно-костной муки, пептоном, при индифферентном отношении популяции к добавлению пантотената кальция и валина. Вакцинные препараты, приготовленные из выращенных культур были безвредны и иммуногенны.
Попова Т. Е. (1997) сравнивала кулыурально-морфологиче-ские свойства P. multocida при выращивании в среде 199 и бульоне Хоттингера. Установлено влияние различных концентраций глюкозы в среде 199.

4.3. Сем. Пастереллы Род Пастереллы
Hofer M. et al. (1982), Коломнина Г. Ф. и соавт. (1988) изучали влияние различных условий культивирования на рост Pasteurella multocida.
Коротеева Л. А. (1991) готовила питательные среды для культивирования вакцинных штаммов кампилобактерий и пастерелл на основе ферментативного казеиново-дрожжевого гидролизата. Позже Коротеевой Л. А. и соавт. (1996) предложена для культивирования пастерелл среда на основе лактопептона, биологические испытания которой показали ее перспективность.
Sandhu Т. et al. (1991) отмечают отсутствие роста на цитрат-ном агаре Симмонса и агаре МакКонки всех штаммов Р. апа-tipestiber, выделенных от уток и другой домашней птицы в США, Сингапуре, Англии и Германии.
Gatewood D. et al. (1994) изучали влияние состава культураль-ной среды на экспрессию специфичных белков внешней мембраны P. haemolytica, образование капсулы и лейкотоксина.
Moore M. et al. (1994) разработали селективную обогащенную среду для выделения пастерелл от птиц и окружающей среды.
Mosier D. et al. (1994) провели сравнительное исследование супернатантных антигенов пастерелл серотипа-1, выращенных на среде без сыворотки и с добавлением альбумина сыворотки плодов коров и сыворотки лошади.
Регламентная среда для культивирования возбудителя пасте-реллеза свиней и птиц готовится на основе ферментативного гидролизата мяса с добавкой пептона и минеральных компонентов. В связи с высокой стоимостью исходного сырья Клыков С. П. и соавт. (1996) предлагают среды приготовленные из альтернативных источников. Сопоставимые результаты роста пастерелл получены на смесях панкреатических гидролизатов рыбно-кост-ной муки, крови и казеина при общем содержании аминного азота 200250 мг%. Среды, на основе любого отдельно взятого
Род Хемофилус
Бактерии рода Haemophilus вызывают различные заболевания как у людей, так и у животных. Из-за требовательности гемо-филов, обнаружение и выделение патогена возможно только на высококачественных средах с удовлетворительным составом (Czukas Z., 1986), содержащих X и V факторы роста. Эти микроорганизмы очень чувствительны к влиянию внешней среды, физических и химических факторов. Трудности бактериологической диагностики связаны также с антагонистическим влиянием на их рост ряда бактерий. Поэтому совершенствование методики выделения гемофильных палочек проводится в направлении повышения чувствительности питательных сред и создания селективных условий. Широкое применение нашли среды Левенталя, Филдса, сердечно-мозговая, с гемином, шоколадный агар и др. Селективные условия создаются антибиотиками бацитрацином, клаксоциллином, ванкомицином. Нестабильность одних сред, трудоемкость и высокая стоимость приготовления других побуждают к их усовершенствованию. В частности, для выделения гемофильных палочек предлагается «витаминный агар» с олеатом натрия (цит. по Фаустовой М. Е., 1980).
Н. aegypticus, как и Н. influenzae, могут вызывать острые конъюнктивиты. Характеризуются своими ростовыми потребностями и, в отличие от Н. influenzae, не растут на триптиказо-со-евом агаре с добавлением X и V факторов, плохо растут на яичной среде, шоколадном агаре и несколько лучшена агаре Колумбия. Эти различия отчасти могут быть объяснены содержанием крахмала в среде. Жирные кислоты яичной среды токсичны для Н. aegypticus и подавляют его рост, что может быть использовано для дифференциации Н. aegypticus, и Н. influenzae, а также для определения его питательных потребностей (Abdel-AzizH. etal., 1986).
Balke E. et al. (1988) показали возможность дифференциации видов и таксонов Haemophilus по реакции расщепление L-алани-

164
165
риями могла быть обнаруживаема и уровень, следовательно, определялся между 1 и 150/г.
Raccach M., Geshell D. (1995) показали ингибирование нескольких штаммов L. monocytogenes (CA, ОН, SA и V7) в молоке истощенной средой, обезвоженной педиококками (dehydrated pediococcal spent mediumDPSM). Зоны ингибирования формировались против всех тестируемых штаммов листерий.
EkJund M. et al. (1995) изучали сферу действия и источники L. monocytogenes в рыбных изделиях холодного копчения и продуктах предприятий перерабатывающей промышленности. Популяции L. monocytogenes инокулированные на поверхности соленых кусков лососи изменялись очень незначительно в процессе холодного копчения при температуре от 22,230,6°С в течение 20 ч, с или без применения дыма, но когда температура обработки снижалась до 17,221,1°С, популяции уменьшались в 1025 раз когда дым применялся. Проникновение L. monocytogenes внутрь этих кусков увеличивалось в 26 раз при 17,221, ГС и в 100 раз при 22,230,6°С, независимо от присутствия дыма.
Показана реверсия покоящихся форм листерий в вегетативное состояние под воздействием фетальной сыворотки и ауксина (Пушкарева В. И. и соавт., 1997).
Capell С. et al. (1995) предлагают метод и среду для электрического определения Listeria spp. в пище. Описывают усовершенствование жидкой среды для детекции видов листерий мониторингом емкости образцов пиши, предварительно обогащенных в бульоне UVM 1. Показан быстрый рост L. monocytogenes в жидких средах с селективностью, основанной на антибиотиках присутствующих в Oxford-arape. Концентрации Оксфордских селективных агентов в конечном варианте емкостной среды были выше, чем в собственно Oxford-arape, и эта среда не требовала проведения реакции эскулин/цитрат железа-аммония. Среда базировалась на способности листерий индуцировать изменение более чем на 30% ее емкости в течение 30 ч. При параллельном сравнении выявления листерий в тестируемых образцах крупной пищевой компании, метод дал меньшее количество ложнополо-жительных результатов, чем использование Fraser-бульона.
Выделение L. monocytogenes путем посева материала на плотные среды считалось невозможным, так как при этом затруднено разграничение данного микроорганизма от непатогенных листерий. Foret J., Dorey F. (1997) показали быструю идентификацию L. monocytogenes на селективной среде ЕНА. Основой среды является Columbia-агар с 5% бараньей крови и с добавлением сфингомиелиназы (10 ЕД/л), способствующей образованию четких зон гемолиза вокруг колоний. Добавление 0,4% 4-метилум-беллиферил-Р-О-глюкозида позволяет идентифицировать род листерий по флуоресценции колоний в ультрафиолетовом свете при 450 нм. Среда содержит 1 % хлорида лития и комплекс антибиотиков (SR 1400 «Oxoid»). Высеваемость на предложенной
среде была значительно выше, чем на средах Oxford и Palcam. Селективную среду Palcam для изоляции листерий выпускают многие зарубежные фирмы.
Ottaviani F. et al. (1997) испытали селективную агаровую среду САС для L. monocytogenes с добавлением селективного коктейля и дифференцирующего реагента, состоящего из смеси металлов, а также очищенных фосфолипидов. Через 24 ч на среде развиваются голубые колонии рода листерий, a L. monocytogenes окружены мутным ореолом. Применение САС рекомендовано для первичного выделения L. monocytogenes как экономичный и быстрый метод.
8.4. Род БАЦИЛЛЫ
К этому роду относится В. anthracisвозбудитель одной из опаснейших болезнейсибирской язвы. С другой стороны, бациллы имеют длительную историю применения в биопромышленности и экспериментальной микробиологии. Коммерческое значение их обусловлено, в основном, производством ферментов для приготовления пищи, напитков, детергентов. Особой отдачи ожидают от секвенирования генома В. subtilis (Harwood С, 1989).
Элективные среды для В. anthracis подробно описаны Norris J. et al. (1981) и Parry J. et al. (1983).
Решающим дифференциально-диагностическим тестом идентификации палочки сибирской язвы является обнаружение капсульных бацилл (Шляхов Э. Н. и соавт., 1978). Известно, что капсулообразование В. anthracis, регулярно протекающее в живом восприимчивом организме, с трудом воспроизводится in vitro. В последнем случае применяются различные элективные среды, у большинства из которых обязательным компонентом является нативная бычья или лошадиная сыворотка крови в относительно высокой концентрации (среды ГКИ, Лефлера, сывороточные агар и бульон). Среды содержат кровь, яичный белок, мозговую ткань, бикарбонат; культивирование проводят в атмосфере 1050% СО2. С этой же целью используются среды Торна и Буза, а также предложенные Томовым А., Тодоровым Т. (1966), Chu H. (1952), Schaefer W. (1963). Кровь и ее сыворотка являются адсорбентами факторов, ингибирующих капсулообразование на питательной среде (Schaefer W, 1963). Но все перечисленные среды сложны в приготовлении, некоторые из них многокомпонентны. Наиболее четко капсулообразование у В. anthracis отмечается на цельной жидкой или свернутой сыворотке (среда Лефлера), а также на 40%-ом сывороточном агаре.
Калиновский А. И. и соавт. (1983) разработали методику получения капсулы у В. anthracis на молочно-солевом агаре, который готовили общепринятым методом: 5% стерильного молока обработанного хлороформом добавляли в расплавленный и осту-

252
253
женный 3%-ый солевой агар; бациллы культивировали в 10% ССЬ. Эту среду рекомендуется использовать для выявления способности В. anthracis синтезировать капсулу in vitro (Метод, ре-ком. ..., 1985).
Машков А. В. (1960) предложил питательную среду для культивирования В. anthracis в капсульной форме.
Влияние сыворотки крови, углекислоты или бикарбоната натрия на образование капсул в культуре вирулентных штаммов В. anthracis изучали Meynell E., Meynell G. (1964).
В 19601962 гг. Архипова В. Р. предложила метод быстрого выявления капсулы сибиреязвенного микроба на среде ГКИ (ГИСК им. Тарасевича). По степени капсулообразования на ней можно судить о вирулентности В. anthracis. Эта среда пригодна для ускоренной индикации данного микроба (Бойков Ю. И., 1968). Кроме того, для этих целей рекомендуется использовать бульон Хоттингера с 40% инактивированной сыворотки (Салтыкова Р. А., 1976), свернутую сыворотку (Михайлов Б. Я. и соавт., 1960).
Шляхов Э. Н. и соавт. (1978) предлагают плотную среду, в состав которой вместо крови или ее сыворотки входит в качестве адсорбента ингибиторов капсулообразования активированный уголь (авт. свид-во № 515355 от 28.01.76). Она содержит (%): DL-цистин0,01; активированный уголь0,2; бикарбонат натрия0,1; агар Хоттингерадо 100. Среда экономична, способствует более четкому выявлению капсулообразования В. anthracis и проста в приготовлении.
Найманов П. И., Соркин Ю. И. (1984) рассматривают дополнительные факторы роста В. anthracis в условиях капсулирования in vitro.
Низамов Р. Н. и соавт. (1992) предлагают для выращивания капсульной формы сибиреязвенного микроба среду, содержащую 3540 об.% сыворотки крови КРС и в качестве солевого раствора, с целью упрощения и удешевления ее состава, 6065 об.% свежей мочи здорового человека.
Акулова М. Ф. (1964) модифицировала агаровую среду для дифференциации сибиреязвенных бацилл.
Николаев Е. С. и соавт. (1966) рекомендуют использовать отходы производства иммуноглобулинов в изготовлении питательных сред для культивирования В. anthracis.
Доценко В. А. (1979) рассматривали оптимальный вариант питательной среды для получения сибиреязвенного протектив-ного антигена.
Ярощук В. А. и соавт. (1985) предлагают выделять сибиреязвенный микроб из молока используя либо сухой питательный агар с ингибиторами, разработанный НИПИ Кавказа и Закавказья, промышленное производство которого налажено в Ставропольском НИИ вакцин и сывороток, либо, при отсутствии его, использовать дифференциально-диагностическую среду, приготовленную на агаре Хоттингера рН 7,67,8 с аминным азотом
130140 мг%, куда добавляют ингибиторы и индикатор в количестве М-сульфата полимиксина 250 ЕД/мл, триметоприма 100 мкг/мл и фенолфталеин-фосфата натрия 0,01%/мл.
По мнению Ипатенко Н. Г. и соавт. (1994) регламентированные способы экспресс-диагностики сибирской язвы путем выращивания микроба на искусственных питательных средах (Рево М. В., 1914), глюкозо-сывороточной среде (Lastia G., 1958), специальной среде ГКИ (Архипова В. В., 1971) и других (Груз Е. В. и соавт., 1974; Sterne V. et al., 1957) не отвечают требованиям ветеринарной лабораторной практики из-за неполноценности их состава и низкого, вследствие этого, капсулообразования. В результате авторами разработана среда, где в качестве источника азотистого питания используется сыворотка крови КРС, а источника ионов ССЬ2 и щелочного агентагидрокарбонатная магниево-кальцево-натриево-природная минеральная вода (ОСТ 1810773).
Welkos S., Keener T. (1986) отмечают более высокую вирулентность у культур В. anthracis, полученных на жидкой питательной среде.
Chung I., Forst A. (1970) изучали питательные потребности В. anthracis. Bojoi P. et al. (1973) использовали для выращивания В. anthracis вытяжку кукурузы. Ikegami Т. et al. (1976) изучали характер роста колоний В. anthracis на среде, содержащей тиогли-колят.
Бакулов И. А. и соавт. (1981) предлагают для выращивания бацилл среду, включающую дрожжевой экстракт и соли калия, кальция, магния, марганца, железа и аммония. Недостатки ее рассмотрены Степиным А. А. и соавт. (1994).
Элошвили Н. И. (1975) изучал вопросы усовершенствования питательной среды для культивирования шт. СТЙ-1.
Найманов П. И. (Naimanov P.) и соавт. (1984) рассматривают питательные потребности В. anthracis и особенности роста вакцинного штамма СТИ в условиях периодического культивирования на жидких синтетических средах.
Diego A. (1962) исследовал способность различных препаратов пептона подавлять рост спор В. anthracis в питательных средах. Влияние сывороток крови различных видов животных на прорастание спор В. anthracis изучали Srinivasan V. et al. (1972). Среду для споруляции В. anthracis предлагают Kim H., Goepfert J. (1974). Еременко Е. И. (1983) рассматривал влияние L-аланина на прорастание спор сибиреязвенного микроба. Факторы, влияющие на рост спор В. anthracis, изучали Thibault R., Manchel R. (1987).
Волкова В. П. и соавт. (1985) изучали зависимость спорообразования вакцинного штамма бациллы СТИ от минерального состава сырья. Наибольшая споруляция отмечалась в присутствии солей магния и марганца, а при наличии дополнительного источника энергии (глюкоза)в сочетании каждого из них с фосфатами. Марганец по данным многих авторов (Hodges N.. Brown R.. 1974; Oh Young, Freese E.. 1976: Перт, 1978; Смирнов В. В. и

254
255
соавт., 1982) принимает непосредственное участие в споруляции многих видов бацилл.
По данным Романова Г. И. и соавт. (1991) из жидких питательных сред, использованных для получения споровой культуры сибиреязвенного штамма СТИ-1, наиболее перспективной оказалась среда, основу которой составляет суточный ферментативный гидролизат гороха. Она обеспечивает спорообразование на уровне 9098%, накопление бактериальной массы 500 780 млн/см3 и высокую иммуногенную активность, с сохранением этих свойств в течение двух лет.
Угримов С. А. и соавт. (1992) рекомендуют для повышения спорообразования сибиреязвенного микроба питательную среду, которая содержит (г/л): в качестве питательной основы амино-пептид 34 и ферментативный гидролизат кормовых дрожжей 46; в качестве источника углеводаманнит 1,01,5; а из минеральных веществхлорид натрия 46; гидроокись натрия 0,1 0,15; а также агар 1517.
Бакулов И. А. и соавт. (1993) с целью сокращения времени на получение спорового материала В. anthracis в питательную среду с источником азота в виде 6080 мл кислотного гидролизата говяжьего мяса и 1,52,5 г/л сульфата аммония дополнительно вводили 312 г/л фосфата калия двузамещенного; 0,81,2 г/л цитрата натрия; 0,150,25 г/л сульфата магния; 0,080,12 мл/л поли-пропиленгликоля. Культивирование осуществляется в течение 4650 ч, из них первые 2729 ч при аэрации. Эти же авторы (1993) для повышения уровня спорообразования, выхода спор и ускорения культивирования (в течение 1618 ч) В. anthracis предлагают среду инкубирования, состоящую из гидролизата кормовых дрожжей с содержанием общего и аминного азота 1,21,5 г/л и 0,50,7%, соответственно; агара 3540 г/л; NaCl 46 г/л; окса-лата натрия 0,81,2 г/л; фосфатов калия однозамещенного 3 7 г/л и двузамещенного 512 г/л; твина-80 0,20,4 г/л.
Зотов А. П., Терентьева Ф. А. (1963) изучали вопросы культивирования В. anthracis на минеральных средах.
Шелохович А. И. и соавт. (1990) для упрощения и ускорения способа получения атоксигенных вариантов возбудителя сибирской язвы использовали плотную среду с 1525% лечебной антисибиреязвенной сывороткой.
Андрус В. Н. и соавт. (1987) показали увеличение концентрации биомассы возбудителя сибирской язвы при добавлении в питательную среду перфтордекалинафторуглеродистого соединения, растворяющего аномально высокое количество кислорода.
Готтшалк Г. (1982) отмечает особую склонность многих видов бацилл к денитрификации.
Микшис Н. И. и соавт. (1991) определяли питательную потребность 17 штаммов сибиреязвенного микроба на модифицированной синтетической среде, удобной для проведения генетического анализа В. anthracis. Установлена абсолютная зависи-
мость всех культур в метионине в сочетании с потребностью в одной или двух нижеследующих аминокислот: цистеина, треонина, орнитина или глутаминовой кислоты.
Knissely R. (1965) рассматривает дифференциальные среды для идентификации В. anthracis и приводит сравнительные данные об эффекте раствора гематина в среде на выявляемость данного и родственных ему микроорганизмов. Несколько позже Knissely R. (1966) предложил селективную среду для выращивания В. anthracis.
Бойков Ю. И. (1968) рекомендует дифференцировать В. anthracis по росту на МПА с пенициллином.
Найманов П. И. и соавт. (1992) при изучении популяционного состава 19 бескапсульных штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных от больных, животных и окружающей среды, использовали специальные дифференциально-диагностические среды.
Храмов М. В. и соавт. (1991) предлагают использовать в производстве сред для культивирования сибиреязвенных вакцин некоторые промышленные источники непищевого сырья. Вопросам питательных сред для возбудителя сибирской язвы посвящены авт. свид-ва № 1809556 (1987) и № 1538508 (1988). В настоящее время щгативосибиреязвенные вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ на предприятиях Биопрома России готовят с использованием как плотных, так и жидких питательных сред. По данным Гаврилова В. А., Числова Ю. В. (1996) вакцины, приготовленные из бактериальной массы, выращенной на жидкой среде, более иммуногенны за счет присутствия в них протективного сибиреязвенного антигена.
Гаврилов В. А. и соавт. (1997) культивировали вакцинный штамм 55-ВНИИВВиМ в жидкой споруляционно-ростовой среде, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, фосфат калия дву-замещенный, хлорид кальция, сульфаты цинка, меди, железа и аммония.
Колесов С. Г. (1976), Лабинская А. С. (1978), Кочемасова 3. Н. и соавт. (1987) приводят рецептуры сред Буза, Томова и ГКИ для обнаружения сибиреязвенных бацилл. В справочнике ветеринарного лаборанта (Андросов Ф. 3. и соавт., 1981) даются, кроме того, рецептуры следующих сред для выращивания и дифференциации В. anthracis: Дрожжевкиной, МПА с пенициллином, дрожжевые агар и бульон по Мещерякову, пшеничный и гороховый агары.
Dao Trjng-Hung (1972) изучали влияние концентрации различных веществ и солей в питательной среде на прорастание бацилл, в том числе возбудителя сибирской язвы.
Комоско Г. В. и соавт. (1988) показали возможность замены в среде культивирования В. anthracis штамм СТИ-1 рыбной кормовой муки гидролизатом казеина.
Johnatan L. Keit et al. (1992) предлагают среду для выращивания и идентификации бацилл из окружающей среды, содержащую КГЧОз, люминол, З-амино-1-тирозин и агар с гриптиказой при соотношении компонентов 600:5:4:2000.

256
9 3-235
257
Фирантас С.-Г. А. и соавт. (1982) предлагают питательную среду для В. subtilis G-78 с целью получения (3-манназы.
Устинников Б. А. и соавт. (1991) разработали среду для глубинного культивирования В. subtilis ВКПМ В-2595продуцента сс-амилазы, содержащую (мас.%): кукурузную муку 1220; мел 0,20,5; мочевину 0,40,5 и воду до 100, а также, дополнительно, с целью увеличения активности продуцента и снижения себестоимости продукта, сухие кормовые дрожжи 0,30,6; сульфат аммония 0,61,3 и тиамин 0,00330,0045.
Подберезный В. В. и соавт. (1996) рекомендуют для В. subtilis свою среду из нативной подсырной сыворотки, обогащенную солевыми компонентами (сульфат железа, двузамещенный фосфат калия, молибденат аммония, бикарбонат натрия). Она превосходила по накоплению биомассы МП Б и молочную сыворотку В. И. Никитенко.
Осадчатая А. И. и соавт. (1997) исследовали влияние широкого спектра источников углеводов на рост промышленно важных штаммов В. subtilis. В сравнении с традиционной глюкозой стимулирующий эффект зеленой патоки были выше в 2,7 раза, а глюкозы в сочетании с ксилозойв 2,5 раза. В результате подобран оптимальный состав компонентов питательной среды.
Чаплинский В. Я. и соавт. (1992) предлагают для выращивания спорообразующих аэробных бактерий В. subtilis и В. licheni-formis среду, содержащую 500600 г/л пивного сусла; 5060 г/л гидролизата мяса; 2530 г/л агар-агара, воду и дополнительно, с целью повышения выхода биомассы, увеличения антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке, 50100 г/л хлоропластной фракции зеленого сока из листо-стебельной биомассы люцерны.
Рак Н. (1993) исследовал образование бацитрацина В. licheni-formis при различных культуральных условиях. Главными компонентами среды являлись глюкоза, (NH^SC^, KH2PO4. СаСОэ используется для снижения ингибирующего действия глюкозы. Замена (NH.»)2S04 на глутаминовую кислоту повышает выход продукта в 45 раз.
Усанов Н. Г. и соавт. (1992) предлагают способ выделения бактерий В. macerans из почвы, включающий получение накопительной культуры из образца почвы посевом на питательную среду, состоящую из а-циклодекстрина 310 г/л; кукурузного экстракта 0,19-0,21 г/л; КШР04 0,19-0,21 г/л; (Nf^HPO* 0,19-0,21 г/л и последующим пересевом на агаровую среду (картофельно-глюкозный агар).
В. cereus известен как возбудитель мастита сельскохозяйственных животных, а также широкого спектра заболеваний человека.
Mossel D. et al. (1967) разработали элективно-индикаторную среду для В. cereus, в которой используется характерная для данного микроорганизма лецитиназная активность и неспособность
258
усваивать маннитол, а элективность обеспечивается добавлением полимиксина.
Kim H., Goepfert J. (1971) описали среду с полимиксином и яичным желтком, а среда Кендала расчитана на сбраживание маннитола и реакцию с яичным желтком (Parry J. et al. (1983).
Holbrook R., Anderson J. (1980) разработали селективно-диагностическую среду РЕМВА для изоляции и подсчета В. cereus, включающую пептон, маннитол, хлорид и пируват натрия, сульфат магния, фосфаты, бромтимоловый синий и агар-агар. Выпускается в настоящее время фирмой «Oxoid» под коммерческим названием «Cereus Selective Medium».
Левина Е. Н. и соавт. (1974) для накопления токсина В. cereus применяли модифицированную ими среду Торна с добавлением 1% сыворотки, глюкозы и бикарбоната натрия.
Кочемасова 3. Н. и соавт. (1987) приводят рецептуры следующих сред для обнаружения В. cereus: солевого полимиксинового агара с ТТХ, глюкозопептонной среды и среды Донована.
Mazas M. et al. (1995) показали высокую эффективность (по проценту споруляции и термостабильности спор В. cereus) питательного агара с Мп2+, обогащенного питательного агара, среды Angelotti и молочного агара.
Devasconcellos E, Rabinovitch L. (1995) предложили новую формулу альтернативной селективно-индикаторной культур-альной среды без антибиотиков для изоляции и предварительного подсчета В. cereus в пищевых продуктах. Эта среда VPvM дает возможность как индикации гидролиза яичного лецитина, так и четкой идентификации колоний В. cereus и соответствующих видов В. thuringiensis, не только по морфологии, но также по цвету. С другой стороны, В. megaterium ингибируется в VPvM. потому что среда содержит комбинацию Триса и окисленного редуцированного резазурина. При отсутствии обеих этих субстанций ин-гибирования не наблюдается. Данные соединения присутствуют при рН 8,2±0,1 в рецептуре, которая также содержит триптон, яичный желток и солиингибируют или тормозят рост других микроорганизмов обнаруживаемых в пищевых продуктах. В сравнении с традиционной средой Mossel (MYP), представленная имеет два положительных качества: не требуется наличия антибиотиков, таких как полимиксин В; несложность и возможность быстрого изготовления в лабораторных условиях.
Добавление стрептомицина в комплексные среды эффективно при выделении любых штаммов В. sphaericus (Hertline В. et al. 1979).
Элективная среда BATS для штаммов В. sphaericus. патогенных для насекомых, разработанная Yousten A. et al. (1985), содержит аргинин в качестве единственного источника азота, углерода и стрептомицин.
Pundle A., Sivaraman H. (1994) оптимизировали среду для продукции пенициллин-У-ациклазы В. sphaericus (NCIM 2478),
9* 259
продуцировавшего высокие уровни этого фермента (100 Ед/г сухих клеток) когда росли на жидкой солевой среде с погруженными зернами при 25°С в течение 20 ч. Дополнение среды 1 % (w/y) пшеничными отрубями или их водным экстрактом приводило к более чем 70%-ому увеличению общей ферментативной активности. Удаление NazHPCb, MgSCb, СаСЬ, FeSCK CuSO и KCI из среды на рост и продукцию фермента не влияло.
Yamaguchi N. et al. (1993) изучали эффект Сахаров на образование микробиологического пиразина Natto В. в синтетической жидкой среде, содержащей различные источники углерода. 14 пиразинов были идентифицированы с помощью GC и GC-MS. Наибольший выход пиразинов наблюдался при добавлении глюкозы и общее количество пиразинов составляло более, чем 42 мг/л культурального бульона. 17 источников углерода разделили на 5 групп (А, В, С, D, Е) моделей образования пиразина. В случае группы A (D и L-арабиноза, ксилоза, галактоза и сорбоза), 2-ме-тилпиразин являлся основным продуктом. В группе В (глюкоза, фруктоза, манноза, сахароза и маннитол) основными продуктами были триметил- и тетраметил-производные. Основным продуктом группы С (трегалоза и сорбитол) являлся 3-этил 2,5-диметил-пиразин, а для группы D (раффиноза и стахиоза) был 2,5-диме-тилпиразин. Группа Е (L-рамноза, мальтоза и лактоза) не могла относиться к каким-нибудь другим группам. Выход пиразинов в культуральных бульонах был сопоставим с клеточным ростом в каждой группе, за исключением группы Е.
Nakajo M., Moriyama Y. (1994) разработали селективную среду т-ТАА и метод подсчета для температурорезистентных спор В. со-agulans. Это один из принципиально-причинных организмов, ответственных за порчу по слабокислому типу пищевых продуктов термообработанных и герметически упакованных. Для приготовления среды 10 г фитона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г декстрина и 4 г фосфата калия были растворены в 500 мл дистиллированной воды и доводили рН раствора до 4,6. Другой раствор получали растворяя 20 г агара в 500 мл дистиллированной воды. Оба раствора автоклавировались при 121°С в течение 15 мин и перед использованием смешивались после расплавления. В залитом диске среды инкубировали при 55°С в течение 5 суток; споры В. coagulans, нагретые до 100°С за 30 мин, продуцировали среднее эквивалентное число видимых колоний на декстрозо-триптоновом агаре (рН 7,0), в то время как нагретые подобным образом споры В. stearother-mophilus, В. circulans, В. licheniformis, В. subtilis, В. cereus, В. mac-erans, В. brevis и В. pumilus колонии не продуцировали. Этот метод селективного подсчета был применен и к пищевым ингредиентам. Все 14 изолятов от колоний сформированных на дисковой среде идентифицировались с В. coagulans.
Buyer J. (1995) разработал плотную среду для подсчета и изоляции почвенных и ризосферных микроорганизмов, названную средой для ризосферной изоляции, содержащую глюкозу и 15 из
20 общих аминокислот. Отсутствие 5 других аминокислот, а именно, аспартиковой кислоты, аспарагина, цистеина, пролина и треонина ингибирует рост В. mycoides, обычно неожиданно встречаемой бактерией, которая быстро распространяется на агаровых средах, усложняя изоляцию и подсчет других микроорганизмов. В сравнении с похожей средой, содержащей казами-новые кислоты, среда для ризосферной изоляции имела половину числа обычно образующихся колоний В. mycoides, с диаметром каждой колонии в 2 раза меньшим. Обе среды имели сходное общее количество бактериальных колоний. Изоляты были разделены на таксономические группы, грубо соответствующие видам и родам, по анализу жирнокислотного метилового эфира и численным методам. В изолятах от среды для ризосферной изоляции обнаруживались 24 рода и 41 вид, в то время как 19 родов и 35 видов обнаруживались в изолятах из среды с казаминовыми кислотами. Но значительная группа бактерий обнаруживалась только на одной из сред, указывая, что 5 отсутствующих аминокислот не имели большого эффекта на другие, чем В. mycoides, организмы. Эта среда может оказаться полезной в исследованиях почвы и ризосферы, где рост В. mycoides нежелателен.
Fernandez P. et al. (1995) изучали влияние рН и типа окислителя (лимонная кислота или глюконо-дельта-лактон) восстановительной среды на температурную резистентность В. stearother-mophilus ATCC 12980. Споры нагревались в бидистиллированной воде в качестве референсного субстрата и в кислотном грибном экстракте с использованием лимонной кислоты или глюконо-дельта-лактона как окислителей (рН 6,2) и субкультивировались в референсной (рН 7) и окисленной (рН 6,2) средах. Рассматривалось повышение чувствительности к рН в период обработки у спор, подвергшихся тепловой обработке. Во всех случаях, значения D были ниже в окисленной восстановительной среде, чем полученные в референсной среде, но тип окислителя, использованный в восстановительной среде не влиял на значения D. Отсутствие влияния на величину z рассматривалось как следствие различий восстановительных сред, но они изменялись в диапазоне от 7 до 10°С как функция различных нагревающих субстратов. Глюконо-дельта-лактон оказался таким же эффективным как лимонная кислота в управлении микробиологической порчей пищевых продуктов. РН имеет большое влияние на уменьшение значений D, особенно когда подкисление субстрата и восстановительной среды сочетаются. Следовательно необходимо использовать данный эффект при подсчете в процессе вычислений или подтверждении результатов.
Schuster К. et al. (1995) разработали синтетическую среду для непрерывного культивирования В. stearothermophilus PV 72 с целью совершенствования методики получения фрагментов клеточной стенки с определенными, важными для биотехнологии. свойствами.

260
261
Соломатина П. С. и соавт. (1984) предлагают питательную среду для В. thurengiensis.
Liu W, Bajpai R (1995) модифицировали известную ростовую среду для В. thuringiensis с целью использования при периодической с высокой плотностью ферментации. Среда была выбрана для ограничения сложной питательной потребности при периодическом и непрерывном культивировании. Установлена эффективность добавления дрожжевого экстракта или отвара зерна, тогда как соли и аминокислоты не оказывали действия. При культивировании во встряхиваемых бутылях уменьшение концентрации глюкозы и добавление отвара зерна делало среду углерод-ограниченной. Перечисленные модификации среды позволяли получать более высокую плотность клеток.
Takagi H. et al. (1995) увеличивали продукцию щелочной эла-стазы, в том числе новым, с высокой эластолитической активностью, алкофильным штаммом Bacillus путем изменения состава культуральной среды. Суммарную активность увеличивали в 3 раза используя кислотный гидролизат соевых бобов; выход продукции заметно возрастал после преципитации с сульфатом аммония.
Ряд сред, предназначенных для выделения В. aminovorans с триметиламином в качестве источника N и С (Claus D., Berkeley R., 1986); В. azotofixansагаризованная, не содержащая N, с тиамином и биотином (Seldin L. et al., 1984); В. benzoevorans минимальная с бензоатом в качестве источника С и энергии (Pichinoty Е, Asslineau J., 1984); В. fastidiosusминимальная с мочевиной и аллантионом в качестве источника N и С (Воп-gaerts G., Vogels G., 1976) представлены в работе Амбулос Н. и соавт. (1992).
8.5. Род МИКОБАКТЕРИЙ
Род Mycobacterium включает много патогенных и непатогенных для человека и животных видов, среди которых для практической медицины и ветеринарии имеют значение М. tuberculosis, М. bovis, M. avium и М. paratuberculosis.
Первичное исследование микобактерий предполагает культивирование и определение биохимической активности после выделения: синтез никотиновой кислоты, наличие каталазы, ни-тратредуктазы, уреазы; чувствительность к гидразиду тиофен-2-карбоксиловой кислоты и к циклосерину (Torlotin J., 1986).
В последнее время отмечается снижение высеваемости микобактерий туберкулеза, бактериологические методы позволяют выявить микобактерий лишь у 5070% больных (Голышев-ская В. И. и соавт., 1997) и, в связи с этим, отдельные авторы (Николаева Г. М., 1995; Duncan К., 1997 и др.) рекомендуют больше внимания уделять другим современным методам: моле-кулярно-генетическим и иммунологическим.
Тем не менее, выделение и идентификация возбудителя из патологического материала посевом на различные среды традиционно остается основой лабораторной диагностики туберкулеза, особенно у животных. По сравнению с другими инфекционными агентами, бактериология М. tuberculosis до сих пор является наиболее трудоемкой и сложной (Финкель Е. А., 1985), что определяется как его особенностями, так и сложностью состава питательных сред, трудностями их стандартизации. В большинстве современных микобактериологических лабораторий для выделения чистой культуры возбудителя используют плотные среды, что (учитывая длительный срок репродукции микобактерий, равный 1824 ч), требует в среднем 34 суток для выделения и идентификации М. tuberculosis и дополнительно не менее 23 недель для определения лекарственной чувствительности (Shin-nick Т., Good R, 1995). По данным Duncan К. (1997) получение культуры микобактерий и верификация диагноза туберкулеза охватывает срок от 8 до 17 недель. Соответственно, одним из важных направлений бактериологической диагностики туберкулеза является поиск и создание более эффективных и менее сложных по составу сред для ускоренного выделения возбудителя (Финн Э. Р., 1970, 1972, 1973), которые на сегодня недостаточно совершенны (Гольшеская В. И. и соавт., 1987). Основная масса работ, естественно, касается изучения плотных агаровых и яичных питательных сред. Агаровые среды характеризуются, вследствие их прозрачности, более ранним видимым ростом колоний. Яичные среды включают различные ингредиенты, способствующие ускоренному росту микобактерий туберкулеза, а следовательно и их выделению (этанол, сидений, пировино-градную кислоту, глюкозу и другие препараты) (Malski M., 1980; Bogdanescu V. et al., 1981; Jaqwess P. et al., 1981).
Еще StonebrinkB. (1951, 1952, 1958) предложил среды с пиро-виноградной кислотой для выделения, в основном, М. bovis. В дальнейшем эту среду модифицировали в различных направлениях. Leslie I. (1959) заменил пировиноградную кислоту пирува-том натрия для создания более стабильного значения рН и, тем самым, устранил необходимость дополнительной нейтрализации среды в процессе ее приготовления. Dixon J., Cuthbert E. (1967), Viznerova A., Polansky F. (1972), Fanea E. et al. (1972) подтвердили стимулирующее действие пирувата натрия на микобактерий туберкулеза. Dubos R. (1953) установил наличие более широкого диапазона оптимального для роста микобактерий рН среды у глутаминовой кислоты (5,56,9), в отличие от пировиноградной (6,46,9). Ковалев Г. К., Александров Н. А. (1969), используя оба эти преимущества предложили среду ПГ-30, в состав которой входят как пируват натрия, так и глутаминовая кислота.
Увеличившееся число инфекций, вызванных нетуберкулезными бактериями (М. fortuitum, M. smegmatis, M. avium, M. phley, М. kansasii, M. chelonei и М. butyricum) ставит перед службами

262
263
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 3
1. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МИКРОБИОЛОГИ ЧЕСКИХ СРЕДАХ И ИХ КОМПОНЕНТАХ 5
Классификация сред, терминология 5
Питательные основы 8
Агар-агар и его заменители 10
Сыворотка крови животных и человека 13
Твины 18
Минеральные соли 21
Селективные агенты 27
Красители 27
Антибиотики 38
2. ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 55
Род Псевдомонады 55
Сем. Нейссерии 72
Род Бордетеллы 87
Род Бруцеллы 92
Возбудитель туляремии 99
Легионеллы 103
3. ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ АНА ЭРОБЫ 106
3.1. Сем. Энтеробактерии 106
Род Сальмонеллы 108
Род Шигеллы 121
Род Эшерихии 124
Род Иерсинии 136
Род Цитробактеры 146
Род Клебсиеллы 146
Сем. Вибрионы 152
Сем. Пастереллы 164
Род Пастереллы 164
Род Хемофилус 165
3.4. Род Кампилобактерии 170
4. Сем. СПИРОХЕТЫ 186
Род Лептоспиры 187
Род Трепонемы 192
Род Борреллии 194
5. ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АНАЭРОБЫ 195
5.1. Сем. БАКТЕРОИДЫ 195
Сем. МИКОПЛАЗМЫ 197
ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ КОККИ 209

Род Стафилококки 2W
Род Стрептококки 220*
Род Микрококки 230
Род Энтерококки 230
397
8. ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ ПАЛОЧКИ 232
8Л. Род Клостридии 232
Род Коринебактерии 240
Род Листерии 243
Род Бациллы 253
Род Микобактерии 262
9. ГРИБЫ : 291
10. ПЕРЕЧЕНЬ НОРМАТИВНЫХ ДОКУМЕНТОВ И ОР ГАНИЗАЦИЙ РОССИИ, ИМЕЮЩИХ ОТНОШЕНИЕ К ИЗГОТОВЛЕНИЮ И РЕАЛИЗАЦИИ МИКРОБИО ЛОГИЧЕСКИХ СРЕД 311
10.1. Методические указания, разработки и рекомен дации 311
Министерство здравоохранения 311
Министерство сельского хозяйства и продо вольствия 335
ГОСТы, ОСТы, ТУ, ВФС и ФС 341
Фирмы и организации, изготавливающие и реализующие микробиологические среды и их компоненты на территории России 354
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 361
СПИСОК ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 362
15

Приложенные файлы

  • doc 23704378
    Размер файла: 774 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий