Хорошая сборка инфы по метаболомике


Глава 1. ИНТЕГРАЛЬНЫЙ МЕТАБОЛОМ ЧЕЛОВЕКА
Методами качественного и количественного химических анализов определяют, какие вещества и элементы входят в состав организма человека. Установлено, что состав разных органов, тканей и организма в целом зависит от пола, возраста, расы и меняется от индивидуума к индивидууму. Имеет место так называемая биохимическая индивидуальность человека.

Рис. 1.1. Вещественный состав организма человека (масса - 70 кг) - интегральный метаболом
Исследованиями установлено, что качественные и количественные показатели состава организма меняются в некоторых интервалах, которые принято считать нормой. В частности, рассчитана масса среднего, или стандартного, человека, равная 70 кг.
В расчете на массу «стандартного» человека в литературе приводятся различные нормальные биохимические и физиологические данные. Усредненные биохимические данные по вещественному составу среднего человека (интегральный метаболом) приведены на рис. 1.1.
С помощью количественного химического анализа было определено, что в среднем человеке содержится около 10 кг сухого вещества и 60 кг воды.
Содержание неорганических компонентов определяют по массе золы, образовавшейся от сжигания образцов ткани при такой температуре, когда все органические вещества превращаются в летучие продукты.
В табл. 1.1 приведены основные биохимические компоненты организма человека.
Таблица 1.1. Основные биохимические компоненты метаболома человека
Макрокомпоненты Микрокомпоненты
Водные растворы Витамины
Белки Гормоны
Липиды (жиры) Нуклеиновые кислоты и основания
Полисахариды (углеводы) Микроэлементы
 
Полисахариды - структурные компоненты клеток, а также одной из депонированных форм химической энергии.
Нуклеиновые кислоты - носители и трансляторы генетической информации.
Микрокомпоненты выступают в качестве функциональных компонентов, принимающих участие в различных взаимодействиях.
Все живые организмы состоят из однотипных белков, что говорит об общем их происхождении. Идентичность организмов каждого вида сохраняется благодаря свойственному только этому виду набору нуклеиновых кислот и белков.
1.1. ИОННЫЙ И ГАЗОВЫЙ МЕТАБОЛОМ ЖИДКИХ СРЕД ОРГАНИЗМА
Организм человека в среднем на 60% массы тела состоит из воды. Вода заполняет все составные части клеток и внеклеточного пространства и представляет собой среду, в которой осуществляются биохимические реакции, перенос веществ и химической энергии. Биохимические реакции протекают в водной среде организма при постоянной температуре.
Вода является средой, в которой растворены, или диспергированы, различные вещества, входящие в состав организма. В воде содержатся основные макрокомпоненты организма - белки, углеводы, липиды, а также микроэлементы, нуклеиновые кислоты и другие микрокомпоненты.
Вода - основа циркулирующих в организме жидкостей, она также принимает участие в обменных процессах.
Очевидно, что знание свойств растворов необходимо для понимания биохимических превращений в организме человека.
Растворы имеют большое значение как в повседневной жизни, так и в медицине. По современным представлениям, жизнь возникла в океане, который являл собой водный раствор неорганических и органических веществ. В ходе эволюции живые организмы развивались и менялись. Многие из них покинули океан и перешли на сушу. Однако животные и растения, выйдя из морской колыбели, сохранили в своих организмах водные растворы, содержащие различные неорганические ионы и органические вещества. Растворами являются плазма крови, спинномозговая жидкость и лимфа. Лекарственные вещества эффективны лишь в растворенном состоянии или должны перейти в растворенное состояние в организме.
2.1. МЕТАБОЛИЗМ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ
Метаболизм (от греч. metabole - «движение, изменение, превращение») - совокупность биохимических превращений веществ, поступающих в организм, и взаимопревращения веществ, из которых состоит организм.
Превращения (обмен) веществ в процессах метаболизма осуществляются через цепи последовательных реакций. Эти цепи последовательных реакций называют метаболическими путями (МП).
Характер метаболизма в тканях во многом определяется питанием.
•  У человека и других млекопитающих метаболическим превращениям подвергаются продукты, абсорбируемые после переваривания содержащихся в пище белков, жиров и углеводов.
•  У жвачных животных (и в меньшей степени у других травоядных) целлюлоза переваривается симбиотическими микроорганизмами с образованием низших гомологов органических кислот (уксусной, пропионовой, масляной); тканевый метаболизм у этих животных адаптирован к утилизации в качестве основного субстрата низших жирных кислот.
При экспериментальном исследовании метаболического пути, во-первых, индентифицируют реагирующие компоненты, выясняют стехиометрию и механизм для каждой из последовательных стадий процесса. Заключительным этапом такого исследования является воспроизведение ферментативных реакций в пробирке. Во-вторых, идентифицируют генетические, аллостерические и гормональные механизмы, с помощью которых осуществляется регуляция скорости данного метаболического процесса.
Метаболические пути в целом организме изучают либо методом определения вводимых в организм и выводимых из него веществ (в норме, а также в условиях стресса и патологии), либо методом перфузии (промывки) отдельных органов, либо методом переживающих срезов ткани. Очень перспективным считают метод, основанный на изучении полученных мутантных организмов с генетическими дефектами, а также метод меченых атомов.
Таблица 2.1. Взаимосвязь общего катаболизма (расщепления) и анаболизма (синтеза)

Метаболизм включает катаболизм и анаболизм.
Катаболизм - фаза распада, ферментативное расщепление сложных молекул на более простые, метаболический путь от сложного к простому.
Анаболизм - синтез сложных молекул из малых, метаболический путь от простого к сложному.
В свою очередь, каждый из этих процессов (катаболизм и анаболизм) состоит из двух одновременно протекающих взаимосвязанных процессов:
•  промежуточного метаболизма - последовательности ферментативных реакций распада или синтеза, промежуточные продукты которой носят название «метаболиты»;
•  энергетического сопряжения - превращений энергии в реакциях метаболизма, в результате которых энергия либо запасается в высокоэнергетичных соединениях (АТФ, NADPH), либо расходуется при распаде этих соединений (табл. 2.1).
Процессы общего катаболизма можно разбить на три основные стадии (рис. 2.1).

Рис. 2.1. Три основные стадии катаболизма
Первые две стадии катаболизма - расщепление белков, полисахаров и липидов до пирувата и ацетил-кофермента-А (ацетил-КоА). Третья стадия - цикл лимонной кислоты, основной процесс, обеспечивающий организм энергией и различными метаболитами.
Процессы анаболизма также включают три стадии. Исходными веществами, или строительными блоками, служат для анаболизма соединения, поставляемые процессами катаболизма.
Катаболические и анаболические пути не совпадают между собой.
Метаболизм пищевых веществ. Поступающая в организм пища, в значительной мере состоящая из белков, углеводов и жиров, должна быть деструктурирована до таких компонентов, как аминокислоты, гексозы, жирные кислоты, которые непосредственно участвуют в процессах метаболизма. Превращение исходных веществ в резорбируемые субстраты происходит поэтапно в результате процессов катаболизма, проходящих с участием различных ферментов.
3.1. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ АНАЛИТИЧЕСКИХ ПРОЦЕДУР В МЕТАБОЛОМИКЕ
Выделение метаболитов из тканей и клеток состоит из ряда стадий. Методики обработки тканей и клеток детально разработаны и широко применяются на практике в клинической диагностике.
Первоначально для разрушения межклеточных связей, клеточной стенки и плазматических мембран применяют механическую (в жидкой или твердой среде) или немеханическую (ферментативную, химическую, физическую) обработку ткани (рис. 3.1).
Для ферментативной обработки (как правило, мышечной ткани, перед гомогенизированием) используют трипсин, коллагеназу, протеинкиназу-К и другие ферменты.
При механической обработке для мягкого растирания ткани ее предварительно измельчают ножницами, затем гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма).
В результате получают препарат со смесью метаболитов, содержавшихся в исходном образце.
Аликвоты полученного препарата используют для качественного и количественного анализа в целях определения метаболического профиля исследуемого органа. При этом идентифицируют различные метаболиты и определяют их количества. Проводят анализ полученных данных и ставят диагноз.
Современные методы качественного и количественного анализа - ГХ-МС, ЖХ-МС/МС, CE-МС, FT-МС-спектроскопия, ЯМР-спектроскопия и др.

Рис. 3.1. Последовательность аналитических процедур в метаболомике
3.2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА (ОБНАРУЖЕНИЯ) И ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КОМПОНЕНТОВ ФРАКЦИЙ
3.2.1. Хроматография
Хроматографию открыл и предложил как метод разделения и анализа смесей русский ученый Михаил Семенович Цвет в 1903 г.
Хроматография - аналитический метод, сочетающий в себе и разделение, и количественное определение веществ, входящих в состав многокомпонентных проб.
В основе разных методов хроматографии лежат адсорбционные процессы различной природы. Хроматография - один из немногих методов, сочетающий в себе и разделение, и количественное определение веществ, входящих в состав многокомпонентных проб.
Главным элементом для этих методов анализа являются хроматографические колонки.
Хроматографические колонки - трубки, стенки которых покрыты веществом неподвижной фазы.
В ходе анализа по трубке движется подвижная фаза (газ или жидкость) с исследуемой смесью (рис. 3.2).
В результате непрерывно повторяющихся процессов сорбции и десорбции веществ на стенке трубки происходит разделение компонентов исследуемой смеси.

Рис. 3.2. Принцип разделения в хроматографической колонке
Обязательным условием для проведения хроматографии является наличие двух фаз: неподвижной (стационарной) и подвижной. В результате того, что различные вещества (А, Д, Н) перемещаются вдоль неподвижной фазы с разной скоростью, происходит их разделение (см. рис. 3.2).
Различная скорость перемещения отдельных компонентов смеси вдоль неподвижной фазы связана со сложным характером взаимодействия в системе «вещество - подвижная фаза - неподвижная фаза». По механизму взаимодействия различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, хемосорбционную и молекулярно-ситовую хроматографию.
Колонки характеризуются эффективностью, селективностью и емкостью.
Эффективность является мерой расширения пика вещества при его движении вдоль колонки. При правильном подборе селективности неподвижной фазы удается разделить все индивидуальные компоненты даже самой сложной смеси.
Селективность определяется как разница в степени удерживания веществ разной природы на неподвижной фазе.
Емкость колонки связана с ее физическими размерами и определяет максимальный объем пробы, который можно ввести в колонку без ее перегрузки.
4. Метаболомика
Метаболомика (от англ. metabolomics, греч. metabolism + суффикс -omics - «полный, целый, весь») - научная область, изучающая совокупность всех исходных, промежуточных и конечных продуктов метаболизма и их количественное содержание в организме.
Составные части метаболомики:
•  геномика - идентификация генов человека и мутаций, приводящих к наследственным заболеваниям;
•  транскриптомика - идентификация и определение количества матричных РНК, кодирующих белки, определение закономерностей экспрессии матричных РНК;
•  РНомика - идентификация и определение количества некодирующих РНК, определение закономерностей экспрессии некодирующих РНК;
•  протеомика - идентификация, определение количества индивидуальных белков в биопробах (крови, спинномозговой жидкости, моче, биопсии);
•  липидомика - идентификация, определение количества липидов в биопробах (кровь, спинномозговая жидкость, моча, биопсии).
На рис. 4.1 представлена обобщенная схема процедур автоматизированной постановки диагноза и метода лечения в метаболомике. На схеме показан путь создания моделей, на основе которых выводится метаболический профиль пациента. Важной процедурой является сопоставление индивидуальных показателей с метаболомными показателями в норме и при различных патологиях, хранящимися в базе накопленных и постоянно обновляемых данных в памяти компьютера.
Примером применения метаболомики на основе традиционных методов молекулярной диагностики может служить диагностика ранних артритов.
Артрит (от греч. arthron - «сустав» и -itis - «воспаление») - собирательное обозначение любых болезней (поражений) суставов.

 
Артрит является распространенным заболеванием в человеческой популяции. Наиболее широко распространены ревматоидный, подагрический и псориатический артриты.
Ревматоидный (от греч. ρευμα - «течение») артрит - системное заболевание соединительной ткани с преимущественным поражением мелких суставов по типу эрозивно-деструктивного полиартрита неясной этиологии со сложным аутоиммунным патогенезом. Причины заболевания неизвестны. Косвенные данные - увеличение количества лейкоцитов в крови и скорости оседания эритроцитов (СОЭ) - указывают на инфекционную природу процесса.
Подагра (от греч. ποδαγρα - «ножной капкан») - гетерогенное по происхождению заболевание, которое характеризуется отложением в различных тканях кристаллов солей мочевой кислоты - уратов. Отложение кристаллов происходит из-за повышенного содержания мочевой кислоты в полости сустава в результате нарушения метаболизма пуринов (см. главу 3).
Избыток пуриновых нуклеотидов приводит к чрезмерному образованию и накоплению уратов. Мочевая кислота в норме растворима в крови и выделяется почками с мочой. У пациентов с подагрой кристаллы откладываются в хряще суставов. В результате развивается воспаление суставов, что вызывает боль и припухание этих суставов.
Псориатический артрит - хроническое прогрессирующее заболевание суставов, ассоциированное с псориазом.
Причина псориаза и псориатического артрита в настоящее время неизвестна. Поражение суставов при псориазе нередко напоминает ревматоидный артрит, подагру, реактивный артрит.
Диагностика артритов, особенно на ранних стадиях, представляет собой сложную задачу. Это связано с тем, что причины, вызывающие сходные воспалительные процессы в суставах, могут быть при различных артритах.
Глава 5. КСЕНОМЕТАБОЛОМИКА (КСЕНОБИОТИКИ)
Ксенометаболомика - один из разделов метаболомики, основанный на анализе влияния ксенобиотиков на изменения метаболических процессов в организме человека. На этой основе проводится молекулярная диагностика патологий, обусловленных ксенобиотиками.
Ксенобиотики (от греч. xenos - «чужой» и bios - «жизнь») - любые чуждые для организма химические вещества, вызывающие нарушения процессов жизнедеятельности.
В качестве примеров ксенобиотиков можно привести тяжелые металлы (ртуть, свинец, кадмий), лекарственные средства, синтетические органические продукты бытовой и промышленной химии, синтетические полимерные материалы, нефтепродукты, пестициды, синтетические поверхностно-активные вещества (детергенты).
Попадая в организм, ксенобиотики могут вызывать различные нежелательные эффекты либо непосредственно, либо вследствие образования токсичных ксенометаболитов. К таким нежелательным эффектам относятся токсические реакции, генетические мутации, специфические заболевания, аллергические реакции, ослабление иммунитета.
Пищевые вещества - нутриенты также могут вызывать различные нежелательные эффекты либо непосредственно, либо вследствие образования токсичных метаболитов. Изучением влияния нутриентов занимается нутриномика.
Давно известно, что даже жизненно необходимые элементы и вещества в избыточном количестве могут вызывать в организме вредные последствия. Великий медик Парацельс, живший в XVI в. н.э., говорил о пользе и вреде различных веществ для организма: «Все в дозе».
Состояние организма человека зависит от очень большого числа компонентов. При решении задач метаболомики проводят серию измерений по схеме «доза - ответ». В ходе такого эксперимента постепенно повышают дозу. Одновременно регистрируют изменения состояния организма. По полученным данным строят функцию «доза - эффект».
Допустимую при воздействии дозу и, соответственно, биологический эффект должен оценивать врач.
Жизненная необходимость, дефицит, токсичность необходимых элементов и веществ могут быть представлены в виде кривой зависимости реакции организма от концентрации элемента или вещества в пищевых продуктах.

Рис. 5.1. Кривые зависимости «доза - эффект» для воздействия на организм необходимого химического агента (Х) на биообъект: а - воздействие необходимого химического агента Х; б - воздействие примесного химического агента Х
Приблизительно горизонтальный участок кривой (плато) зависимости воздействия на организм (рис. 5.1а) необходимого химического агента описывает область концентраций, соответствующих норме: оптимальному росту, здоровью, воспроизведению. Большая протяженность плато указывает не только на малую токсичность, но и на большую способность организма к адаптации по отношению к значительным изменениям содержания этого элемента. Наоборот, узкое плато свидетельствует о значительной токсичности элемента и резком переходе от необходимых организму количеств к опасным для жизни. При выходе за плато (увеличении концентрации) все элементы становятся токсичными. Например, существенное увеличение концентрации необходимых микроэлементов может привести к летальному исходу.
Ряд примесных элементов-ксенобиотиков (серебро, ртуть, свинец, кадмий и др.) считаются токсичными. В микроколичествах они не влияют на жизнедеятельность. Но попадание их в организм в больших количествах приводит к тяжелым патологическим явлениям (рис. 5.1б).
Проблемами токсичности пищевых веществ занимается нутриномика (от лат. nutrientia - «пищевые вещества»).
Многие ткани являются мишенью для повреждающего действия продуктов метаболизма ксенобиотиков. Как правило, чем менее токсичен ксенобиотик, тем выше вероятность, что активные промежуточные продукты метаболизма этого вещества будут инициировать различные формы токсических процессов (рис. 5.2).
Глава 6. ТОКСИКОКИНЕТИКА
Токсикокинетика (от греч. toxicon - «яд», kinetikos - «движение») - наука, изучающая кинетические закономерности поступления, распределения, метаболизма и выведения токсичных веществ из организма.
Ответ организма на воздействие токсиканта есть функция дозы и времени, поэтому характеризуется токсикодинамическими и токсикокинетическими закономерностями.
Токсикодинамика изучает формирование токсического эффекта, основанное на равновесных процессах (см. главу 5). Но такие данные недостаточны для оценки токсичности вещества.
Токсический эффект, помимо биохимических свойств, определяется также изменением во времени концентраций токсиканта и его метаболитов в органах и тканях организма. Количественно эти изменения характеризуются токсикокинетическими параметрами: константой скорости (k), периодом полувыведения (t1/2), объемом распределения (Vd), клиренсом (CL) токсиканта.
Знание законов токсикокинетики необходимо для разработки системы профилактики токсических воздействий и диагностики интоксикаций. Данные токсикокинетики широко используют при создании новых противоядий и схем их оптимального применения при совершенствовании методов форсированной детоксикации.
6.1. ТОКСИКОКИНЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ
Токсикокинетические характеристики ксенобиотика зависят от многих факторов: физических и химических свойств вещества, объема органов и тканей, скорости кровотока, проницаемости капилляров и клеточных мембран, рН биосред и характеристик распределения между кровью и тканями.
Формализовать влияние этих факторов удается благодаря использованию токсикокинетических моделей и математическому аппарату, описывающему эти модели.
В токсикокинетике поведение токсичных веществ в организме рассматривают как движение между камерами (частями системы).
Камера отображает ограниченный в пространстве объем жидкости или ткани в организме с одинаковой концентрацией токсиканта по всему объему (рис. 6.1).

Рис. 6.1. Токсикокинетические модели: одно-, двух- и трехкамерная; ki- константы скорости обмена веществ между камерами
Такому определению камеры могут удовлетворять кровь, лимфа, межтканевая жидкость. Между камерами происходят процессы распределения, обмена и выведения токсичного вещества.
В физиологической токсикокинетике организм рассматривается как набор уравнений массопереноса между отдельными органами и тканями. Между камерными и физиологическими моделями нет противоречий, напротив, они дополняют друг друга.
Практическая цель токсикокинетики определяется в первую очередь количественной оценкой концентрации ксенобиотика в разных средах организма во времени. Эти данные необходимы при диагностике и лечении отравлений, а также при химико-токсикологических исследованиях и судебно-химическом анализе.
Токсикокинетические характеристики ксенобиотика зависят от физических и химических свойств вещества, объема органов и тканей, скорости кровотока, проницаемости капилляров и клеточных мембран, кислотности среды и характеристик распределения вещества между кровью и тканями.
Расчет кинетических параметров обмена веществ между камерами основан на законе пропорциональности скорости обмена и концентрации вещества в камерах.
Например, скорость перехода ксенобиотика (Х) из камеры 1 в камеру 2 равна:

где Сх1 - концентрация Х в камере 1; k12 - константа скорости перехода вещества Х из камеры 1 в камеру 2.
Скорость (V12) перехода ксенобиотика (Х) - величина, измеряемая убылью концентрации (Х) в камере 1 в единицу времени:

где t - время.
В соответствии с законом пропорциональности скорости обмена введены показатели: ка - константа скорости абсорбции ксенобиотика из внесосудистого пространства в центральную камеру 1; кэл - константа скорости элиминации ксенобиотика из камеры 1; к1-2, к2-1, к2-3 - константы скорости распределения ксенобиотика между камерами 1, 2 и 3 соответственно.

Проект "Метаболом человека"
Черновой вариант метаболома - метаболического паспорта человека, который представляет все промежуточные соединения обмена веществ в организме, предложили канадские ученые. Об этом сообщает журнал Nucleic Acids Research.
Метаболом человека по своему фундаментальному значению подобен геному человека - совокупности всех его генов, или протеому - совокупности всех его белков. Это как бы химический аналог генома. И если геном представляет программу жизни, то метаболом - ее ингредиенты. Проект "Метаболом человека" (Human Metabolome Project) стартовал в Канаде в 2004 году. Сейчас ученые из Университета Альберты (University of Alberta) в Эдмонтоне каталогизировали и охарактеризовали 2500 метаболитов, 1200 лекарственных препаратов и 3500 пищевых компонентов, обнаруженных в человеческом организме, и опубликовали эту работу в авторитетном журнале Nucleic Acids Research. Авторы убеждены в том, что эти результаты знаменуют собой начало новой эры диагностики и обнаружения болезней. По их мнению, метаболомный проект окажет на медицину и терапию более существенное влияние, чем проект "Геном человека", поскольку метаболомы в качестве индикаторов здоровья и протекающих в организме физиологических процессов несравненно чувствительнее. "Метаболомы - это осведомители генома", - говорит руководитель проекта профессор вычислительной биологии Университета Альберты Дэвид Вишарт (David S.Wishart). По его подсчетам, единичная замена в нашей ДНК может привести к 100-тысячекратному изменению в уровне метаболизма. А представитель "геномщиков" из того же университета доктор Дэвид Бейли (David Bailey) указывает также на значение метаболома для "предсказания, предупреждения и мониторинга многих генетических, инфекционных и связанных с загрязнением окружающей среды заболеваний".
Метаболом находится в исключительной зависимости от того, что человек ест, где он живет, от времени суток, времени года, общего состояния его здоровья и даже от душевного состояния, отмечается в документе, распространенном Университетом Альберты. Располагая в начале проекта химическими и биологическими данными о наиболее известных метаболитах человеческого организма и об их связи с тем или иным заболеванием, канадские ученые за два с половиной года собрали воедино сведения об оставшихся 95% метаболитов, и так получился черновой вариант человеческого метаболома. "На сегодняшний день большая часть медицинских тестов основана на измерении метаболитов в крови и моче", - считает доктор Вишарт. По его оценке, в рутинных клинических анализах задействовано меньше 1% известных метаболитов, в результате очень многое теряется из виду.
«Метаболическое профилирование» и «биохимическое профилирование» — также широко используемые термины для описания метаболических исследований. Метаболическое профилирование является способом определения качества и (или) количества небольших молекул в биологическом объекте. Анализ может включать один или несколько технологических приемов: таких, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография (ГХ), капиллярный электрофорез(КЭФ), МС и ЯМР (81, 82). Исторически профилирование эндогенных метаболитов сводилось к определению специфических соединений или типов соединений. Например, после приема красного вина органические кислоты, находящиеся в моче, или флавоноиды в крови могут быть обнаружены несколькими методами — ГХ-МС, ВЭЖХ-МС или ЯМР. Таким образом, получался «снимок» уровня метаболитов в определенное время и в определенном состоянии. В настоящее время метаболическое профилирование может быть рассмотрено уже в составе (системе) метаболома. Современные аналитические технологии нацелены на качественное и количественное определение всех эндогенных метаболитов в различных типах клеток, тканей и биологических жидкостей. Пока это трудновыполнимо, но ученые ищут пути подобного определения. Проблема заключается в разработке единых (стандартных) аналитических методик определения и регистрации результатов при исследовании биологических объектов.
В течение многих лет определение особенностей метаболизма с помощью скрининга биологических жидкостей было основным методом обнаружения врожденных аномалий метаболизма. Токсикологам необходимо количественное определение специфических метаболитов или классов метаболитов. В настоящее время для обнаружения метаболических маркеров токсичных веществ или лекарственных средств используются самые современные аналитические методы. Для определения большого количества метаболитов стали использовать МС и ЯМР, их разновидности, комбинированные методы (например ВЭЖХ-МС-ЯМР). Данные, полученные в ходе этих исследований для воссоздания реально происходящих процессов in vivo, опираются на установление полной структуры определяемых веществ.
Результаты анализов позволяют классифицировать проявление различных типов токсичности или аномалий в организме. В литературе, посвященной ЯМР-исследованиям, часто используют графические способы представления данных. Получают спектральные картинки, отнесенные к тому или иному метаболому (условно их можно сравнить с характерными паттернами на биочипах). При этом проявляются явные противоречия, касающиеся информации о биомаркерах — метаболитах токсикантов в моче, полученной ранее традиционными методами. Во всяком случае, новейшие тандемные инструментальные методы, например ВЭЖХ-ЯМР, при разделении и определении метаболитов в биологических жидкостях, имеют большие возможности для понимания токсического действия лекарственных средств и других химических веществ. Во многих токсикологических исследованиях в результате мониторинга процессов, происходящих в организме в ответ на действие лекарств, отмечается, что изменения в метаболизме предшествуют гистологическим изменениям. Очевидно, возможность определения однозначных индивидуальных ответных реакций до получения достоверно фиксированных токсикологических или гистологических реакций принесет несомненную пользу пациентам.
В настоящее время метаболомические исследования применяются и для разработки новых лекарств. Доказательством этому является создание в США, Японии и странах Евросоюза небольших компаний по выполнению различных метаболомических анализов для более крупных фармацевтических организаций. Одна из задач этих компаний заключается в быстром получении ранних метаболических маркеров токсичности (или безопасности) лекарств, что может использоваться для оценки качества и безопасности лекарственных средств для животных и людей. Другая задача заключается в открытии новых метаболических маркеров, образующихся в организме человека в ответ на действие лекарств, которые в дальнейшем смогут использоваться для выявления людей, «нестандартно» реагирующих на то или иное вещество. По сути, метаболомика ускоряет процесс создания лекарств и значительно увеличивает шансы на безопасное и эффективное их применение. Метаболомика и метабономика позволяют отличить «нормальный» метаболизм от «измененного».
Каждая биологическая жидкость, анализируемая методом 1Н ЯМР спектрометрии с частотой 800 МГц, имеет свой характерный спектр («отпечаток пальца»), что делает возможным идентифицировать нарушение метаболических профилей не только в крови или моче, но и в извлечениях из ткани клеточных суспензиях. Для этого используют специальные компьютерные программы, анализирующие основные компоненты (АОК) и классифицирующие образцы, согласно их ЯМР спектральным профилям (40, 63). В настоящее время эффективный способ извлечения важной метабономической информации состоит в комбинировании ЯМР-спектрометрии высокого разрешения определяемой биологической жидкости с мультивариантными методами статистики. Основные компоненты (ОК) — новые переменные, созданные от линейных комбинаций стартовых спектральных данных так, что каждый последующий ОК имеет определенное отличие от предыдущего, причем, первый ОК в сравнении с другими имеет разницу в наборе данных в наибольшей степени. Участок первых двух или трех ОК дает лучшее представление о разновидности набора данных в двух или трех измерениях.
Таким образом, создаются карты ОК, способные визуально отразить поведение образцов под влиянием любого ксенобиотика. «Рисунок» ЯМР-спектра биологической жидкости или образца ткани определен его метаболическим профилем (11, 18, 38-40, 64, 65. 76). Это достаточно простой подход для научных исследований. Однако в условиях протекания биохимических процессов in vivo все значительно сложнее, поскольку эффекты, вызванные генетической модификацией, болезнью, пищей, образом жизни, действием введенного препарата, развиваются в режиме реального времени. Для решения подобных многофакторных задач разработаны (и продолжают активно разрабатываться) автоматические методы классификации метабономических данных. На их основе строится математическая модель, предсказывающая правильный выбор класса для каждого образца. Расчетные данные сравнивают с экспериментально полученным ЯМР-метаболическим профилем (13, 15. 16, 20, 21, 23, 42, 43, 52, 75). Методика позволяет количественно описать статистические границы, характеризующие каждый класс образца в терминах их метаболических профилей, и отличить образцы, не принадлежащие ни к одному из классов. Образец может принадлежать как к единственному классу, так и ко многим классам. Построив исчерпывающий ряд моделей, можно предусмотреть классификацию для широкого диапазона биообъектов. В настоящее время, благодаря возможностям такого подхода, установлены биомаркеры токсических повреждений, вызванных рядом ксенобиотиков, генетических повреждений, нежелательных побочных эффектов лекарственных препаратов и пестицидов, фенотипов (метаботипов), сформированных в результате взаимодействия генотипов с внешней средой.
Как уже отмечалось, метаболическое профилирование не связано непосредственно с изучением метаболизма ксенобиотиков. Однако метаболические исследования применялись и для объяснения влияния первичных и вторичных продуктов метаболизма ксенобиотиков на человека. Например, при ЯМР-исследовании мочи и плазмы крови были обнаружены метаболиты, образование которых связано с токсическим действием хлорида ртути, гидразина и ряда антибиотиков.
С помощью ЯМР-анализа были расшифрованы и уточнены многие метаболические процессы — от биосинтеза коферментов в микробах и регуляции метаболизма глюкозы у млекопитающих до реакций переноса метильной группы в структуре метаболита при токсических поражениях печени
Следует отметить, что ни одним из инструментальных методов исследования нельзя полностью показать всю сложность структуры метаболома у прокариот или эукариот. Это зависит от генетической изменчивости, тканевого и клеточного разнообразия, качества питания и огромного числа разнообразных молекул, которые включает в себя метаболом. Аналитики всегда занимались специфическими исследованиями индивидуальных видов (например, гистамин или АТФ) или классов молекул (например, аминокислоты или нуклеотиды), однако цель метабономики состоит в установлении полного набора малых молекул, присутствующих в биологической жидкости. В конце 2002 г. в базе данных КЕГГ (KEGG) насчитывалось более 10.000 соединений, 8.000 из которых имели молекулярную массу 30-1.500 Д. Многие соединения молекулярной массой 1.000-1.500 Д являются пептидами и конъюгатами кофермента   А . Среди соединений молекулярной массой менее 1.500 Д большинство находятся в интервале 100-600 Д. К тому же, многие макромолекулярные структуры (например, мембраны) состоят из плотно, но динамично связанных небольших молекул. Поэтому задача аналитика состоит в том, чтобы доступными методами определить качественные изменения метаболитов, различающихся молекулярной массой, поляризацией, зарядом, устойчивостью. Еще одна сложность заключается в неравномерном распределении метаболитов различных веществ (например, глюкозы или стероидных гормонов) в биологических жидкостях и тканях. Поэтому популярность комбинированного метода ВЭЖХ-ЯМР при идентификации компонентов биожидкостей растет. Миниатюризация аппаратуры и возможности измерения пикомолярных количеств образца привлекают к себе большое внимание. Уже существуют экспериментальные системы для ВЭЖХ-ЯМР, соединенные с Фурье-преобразователем, ИК- и масс-спектрометрометрами. В будущем такие системы дадут возможность анализировать смеси добавок полимера или идентифицировать in vivo неизвестные компоненты, не изолируя их в индивидуальном виде.
Определение компонентов в сложных биоматрицах проводят в объединенных аналитических системах ВЭЖХ-ЯМР-МС, что дает возможность быстрой полной и надежной молекулярной идентификации.
На сегодня известны несколько методик, позволяющих использовать системы ВЭЖХ-ЯМР (82). Самая простая из них — обнаружение веществ по ЯМР-спектрам в режиме реального времени, как непрерывного потока хроматографических пиков элюата. Однако практически для обнаружения используются только 1H или 19F ЯМР-спектрометры.
Другой распространенный подход — сохранение частей элюата в капиллярных петлях для более позднего автономного изучения ЯМР-спектра (выбор пика). Кроме того, поток может быть приостановлен в коротких интервалах времени при пропускании его через ячейку ЯМР («разрезание» времени) аналогично использованию диодного множества УФ-датчика. Такая методика позволяет получить спектры от различных частей пика. «Разрезание» времени особенно полезно, если разделение происходит недостаточно и трудно определить времена удерживания. В современных приборах возможен полностью автоматизированный анализ при контроле программного обеспечения. Автоматизированный анализ может быть приостановлен в любое время с возвратом к «ручному» управлению.
С помощью системы ВЭЖХ-ЯМР-МС можно получить ценные масс-спектрометрические данные, которые в дальнейшем будут использованы для оптимального выбора пиков и их ЯМР-анализа. Так, например, можно установить фрагменты гидроксилированного метаболита или глюкуронида токсиканта. ЯМР-спектры биологических образцов (биожидкостей) чрезвычайно сложны и содержат много тысяч резонансных поглощений. Получить максимальную информацию от сложных спектров можно при использовании машинных методов с использованием специальных математических приемов — мультивариантной статистики.
Предел обнаружения и количественный анализ вещества зависят как от природы определяемых молекул, так и от класса технической сложности оборудования (например, разрешения соответствующего ЯМР-спектрометра). Интеграл резонанса в ЯМР прямо пропорционален количеству соединений в ЯМР-образце. Пределы обнаружения современных ЯМР-спектрометров ограничивают определение метаболитами с концентрацией ≥ 0,1 мМ-6. Предел обнаружения в методе ВЭЖХ-МС зависит от концентрации, степени ионизации компонента и технологического приема исследования иона. С помощью современных систем можно обнаружить субпикомолярные количества молекул в 1 мкл. образцов. Фактором, ограничивающим обнаружение ионов, является ионизация молекул в водном растворе. Степень ионизации для определенной молекулы различается в разных образцах. На исследуемый ион влияют солевые и буферные растворы, например ион натрия, быстро образует аддукт с кислородом, вызывая сдвиг в молекулярном ионе от М + Н (М + 1) до М + Na (М + 23). Ионизация молекул может быть подавлена другими ионами при одновременном присутствии. Все это должно быть проконтролировано и учтено при анализе.
Сложная структурная организация
клеток и тканей представляет большие трудности при исследованиях метаболитов. Схема проведения метаболических исследований представлена на рис. 11. Многие типы образцов требуют разрушения клеток и тканей, центрифугирования, экстракции и концентрирования
Например, для исследования образцов крови новорожденных вначале проводят экстракцию крови с фильтровальной бумаги. Экстракт можно либо сразу исследовать в масс-спектрометре, либо сначала хроматографировать,  а  затем проводить МС-анализ (13). Некоторые стадии могут быть укорочены в зависимости от типа образца и метода анализа. При исследовании биологических жидкостей приготовление образца может включать добавление дейтерированного буфера и внутренних стандартов для ЯМР. Фильтрованные жидкости также могут прямо исследоваться в масс-спектрометре. В любом случае, полное качественное и количественное определение метаболитов в каком бы то ни было образце будет требовать одновременного применения различных методов. Поэтому использование той или иной аппаратуры для метаболических исследований зависит от цели исследования, в частности, от того, является ли задачей исследования полная характеристика метаболической структуры данного образца или сравнительный метабономический анализ. В первом случае оптимальным является использование наиболее чувствительных спектрометров сильного магнитного поля и особых методик. В ряде случаев для определения метаболитов с низким содержанием в пробе может потребоваться комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР. Сравнительные метабономические исследования различных образцов, в которых концентрации солей, белков, величина рН и другие параметры варьируют в ограниченной степени, могут проводиться с помощью спектрометра низкого поля, однако при этом увеличивается общее время исследования. Например, при 300 МГц общее время исследования для достижения нужного уровня чувствительности увеличивается в 4,6 раза по сравнению с исследованием, проведенным при 500 МГц.
Кроме исследований мочи и плазмы крови, метаболические анализы включают также исследование содержимого клетки. Используются различные протоколы, зависящие, главным образом, от того, направлен анализ на гидрофильные компоненты клетки или липофильные. Надежные результаты получают после твердофазной экстракции аналитов. При этом повышается чувствительность при определении нуклеозидов, нуклеиновых оснований и монофосфатов нуклеозидов, но количественные характеристики триглицеридов занижены (ниже контрольных значений).
Метод ЯМР позволяет добиваться почти идеального спектрального разделения компонентов, поэтому анализ смеси, как правило, не требует дополнительного хроматографирования. Однако если число компонентов очень большое или резонансные пики соответствуют больше метаболитам, чем основным компонентам, то используют комбинированный метод ВЭЖХ-ЯМР или ВЭЖХ-ЯМР-МС (82). Изо всех хроматографических детекторов масс-спектрометры в настоящее время имеют наибольшее значение для полного метаболического анализа. Это происходит благодаря быстрому развитию масс-спектральных технологий в последнее десятилетие. Появление электроспрейной ионизации расширило возможности МС при биологических исследованиях; масс-спектры крупных и высокополярных молекул теперь можно обнаруживать либо прямо из биологических образцов, либо после разделения, например, с помощью ВЭЖХ. К тому же, инструментальные методы становятся менее объемными,  а  исследования с применением компьютерных программ открывают новые возможности. Эффективность масс-спектрального детектирования при метаболических исследованиях связана не только с высокой чувствительностью метода, но и с возможностью разделения метаболитов с помощью масс-спектрометра в соответствии с молекулярной массой при минимальном разрешении 1  а .е.м. Таким образом, в зависимости от разрешения конкретного масс-анализатора, количество полос (пиков) масс-спектра может варьироваться в очень широких пределах. Наложение пиков в масс-спектрах происходит, если анализируемые соединения имеют одинаковую молекулярную массу и одинаковую молекулярную формулу (например, различные гексозы). Такие соединения должны быть либо разделены хроматографически перед МС-анализом, либо подвергнуты тандемной МС-МС. Сегодня существует много типов масс-спектрометров, применяемых для метаболических исследований.
Методы ионизации API и ESI используются для перевода полярных метаболитов в масс-спектрометре из водных растворов в ионы газовой фазы. Как правило, многие гетероатомы и функциональные группы (например, COOH и NH2), содержащиеся в молекуле, склонны к ионизации с помощью API. Однако API не позволяет произвести полную ионизацию всех типов биомолекул. Ионизацию можно увеличить при добавлении некоторых летучих буферов к растворителю (например, уксусная, муравьиная, трифторуксусная кислоты, ацетат аммония). ESI-МС — самый распространенный метод исследования биомолекул, который можно использовать с различными масс-анализаторами: такими, как квадруполь, ToF (времяпролетный) или резонанс Фурье-преобразователь — FT. Важно, что ToF обеспечивает быстрое обнаружение спектров, высокую точность и разрешение. Однако метод ToF-МС имеет некоторые ограничения предела обнаружения, зависящие от природы соединений.
Квадрупольные инструментальные методы, благодаря их способности мониторить ионы, используя тандемную МС (МС-МС или МС2), на сегодняшний день являются золотым стандартом чувствительности и предела обнаружения (82).
Метод FT-MС имеет высокую разрешающую способность и дает четкие пики. Однако он сложен и применяется редко; для того, чтобы FT-МС стал методом выбора при метаболических исследованиях, понадобится время.
Для определения метаболитов, обладающих окислительно-восстановительными свойствами, в биологических образцах (таких, как нейромедиаторы, флавоноиды в плазме, эндогенные антиоксиданты в плазме и метаболомы митохондрий) используются способы высокочувствительного электрохимического детектирования в ВЭЖХ. В зависимости от структуры и природы конкретного метаболита чувствительность метода находится в пределах 5-10 пикограммов.
Эффективность работы систем ВЭЖХ-ЯМР-МС можно подтвердить примером. В нескольких крупных медицинских центрах США был проведен анализ 62 метаболитов мочи, включающих органические кислоты и аминокислоты, у пациентов, отобранных в группы по определенным показателям. Метод дал количественные данные (с отклонениями 15 %) для большинства метаболитов и достоверно идентифицировал 105 из 108 больных с наследственными метаболическими заболеваниями.
МЕТАБОЛОМИКА: ЗДОРОВЫ ЛИ ВЫ ИЛИ БОЛЬНЫ? ОТВЕТ ДАСТ АНАЛИЗ МЕТАБОЛИЗМА ВАШЕГО ОРГАНИЗМА
Ученые из Института биоинформатики и системной биологии Центра Гельмгольца (Мюнхен),   а  также сотрудники Факультета биологии Университета Людвига-Максимиллиана показали, что биологические индикаторы заболеваний, вызванных под влиянием факторов окружающей среды, можно обнаружить при помощи системного анализа метаболизма пациента (метаболомики).
Представленный метод также можно использовать для преклинических испытаний лекарственных средств, он позволяет на ранней стадии обнаруживать возможные побочные эффекты новых препаратов.
Метаболомика направлена на изучение совокупности всех молекул клетки или ткани. Ученые-биоинформатики проанализировали данные, собранные в ходе исследования , проведенного на здоровых и больных диабетом мышах. В каждом случае, животным давали лекарство против диабета – Розиглитазон (RoziglitazoneTM). После этого у 40 мышей в плазме крови было выделено более 800 метаболитов, представляющих факторы «здоров/болен диабетом» и «лекарства принимались/лекарства не принимались». Карстен Сур (Karsten Suhre), руководитель исследования в Центре Гельмгольца, объясняет эти результаты так: «Оказалось, что во многих случаях соотношение между концентрацией определенных метаболитов было более информативно, чем их количественная концентрация». При помощи последующей кластеризации статистических данных о парах метаболитов стало возможным определить группы метаболитов, которые разделяют животных по факторам «здоров/болен» и «лекарство принималось/не принималось».
Результаты показали, что биомаркеры диабета можно определить посредством объективного биоинформатического анализа комплексных метаболомических данных, полученных при помощи экспериментов. Сур добавил: «Такой подход можно использовать в совокупности с новой метаболомической платформой (metaP) Центра Гельмгольца для автоматической идентификации групп существенных биомаркеров болезни. К тому же, используя преклинические исследования эффектов новых лекарств, при помощи метаболомики можно на ранней стадии обнаруживать возможные побочные эффекты, оказываемые препаратом на обмен веществ».
До сих пор генетические методы и транскрипционный анализ оставались лучшими инструментами в исследовании болезней обмена веществ. Теперь, прогресс в области массовой спектроскопии позволяет проводить экстенсивное изучение метаболом. Карстен Сур добавил: «Благодаря скачку в области анализа метаболитов, задачей биоинформатики становится развитие особых численных методов, которые помогут справиться со сложными наборами данных, содержащими огромное количество информации».
МЕТАБОЛОМИКА: К ВОПРОСУ О РАЗРАБОТКЕ БОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНЫХ АНТИБИОТИКОВ
В последнее десятилетие было отмечено серьезное снижение эффективности существующих антибиотиков, что может привести к мировому кризису здравоохранения. Открытие исследователей из Университета Виржинии (University of Virginia) предоставляет врачам и пациентам возможность нового подхода к созданию более эффективных антибиотиков. Это будет связано с метаболомикой.
Метаболомика - сравнительно молодая наука - изучает процессы метаболизма. «Именно она и поможет нам. Поскольку бактерии становятся устойчивыми к существующим классам антибиотиков, со временем возникает недостаток потенциальных молекулярных мишеней в бактериальных клетках, на которые могут подействовать вновь разработанные препараты», говорит Джон Г. Бушвеллер (John H. Bushweller), возглавивший данную работу, результаты которой будут опубликованы в журнале Molecular Cell, «Это опасная ситуация, однако наше открытие является начальным пунктом разработки совершенно нового класса антибиотиков, действующих по принципиально иному механизму».
Профессор Бушвеллер и его коллеги расшифровали структуру мембранного фермента DsbB. Подобные ферменты очень важны – достаточно сказать, что кодирующие их гены занимают около одной трети генома клетки человека и являются молекулярными мишенями более чем половины применяемых сегодня лекарств.
До настоящего времени исследователи не имели достаточно информации о структуре этих белков, в то время как определение структуры белка необходимо для получения представления о его функции и о том, как он может послужить в качестве мишени лекарственного препарата. Профессор Бушвеллер и его научная группа решили эту проблему с помощью ядерной магнитно-резонансной спектроскопии – основного метода, применяемого при выяснении структуры органических соединений. Этот подход может теперь стать основным в расшифровке строения других связанных с клеточной мембраной молекул.
Фермент DsbB сам по себе является потенциальной мишенью для действия новых мощных антибиотиков, однако ученые видят основной результат своей работы не в этом,   а  именно в методе характеристики структуры и функций молекул, которые в будущем станут основой новых стратегий терапии.
Заключение
- Генетическая токсикология оценивает результаты воздействия химических и физических агентов на генетический материал и генетические процессы в живых клетках.
- Процессами метаболизма клеток, их делением и дифференцировкой управляет сложная сеть молекулярных взаимодействий, определяющая уровни экспрессии различных генов, информацию о которых можно получить с помощью биочипов.
- Изучение динамики метаболических процессов, происходящих в клетке, и природы метаболитов являются частью исследования структурной организации сетей метаболических потоков, основой выявления принципов их регуляции и определения регуляторных инвариантов, обеспечивающих гомеостаз в сетях метаболических потоков.
- Новые высокопроизводительные технологии, применяемые в генетической токсикологии, позволяют идентифицировать многие мутагены, оценивать риск действия различных токсикантов и развития побочных эффектов лекарственной терапии в зависимости от индивидуального гено- и фенотипа.
- Масс-спектрометрический анализ полиморфизма ДНК — эффективный способ определения полиморфизма с очень низкой стоимостью одного определения и высокой производительностью. Возможность мультиплексного определения мутаций или замен позволяет определять до 1.000.000 точек в день.
- Технология метаболомики и метабономики и использование аналитических систем ВЭЖХ-МС-ЯМР или ВЭЖХ-МС 2–ЯМР (или других, например ВЭЖХ-МС- ЯМР- ИСП*-МС) позволяет определять профили метаболических заболеваний или экологических нарушений до того, как у человека возникнут соответствующие симптомы. Определение метаболома даст возможность полнее понять интерактивную природу клеточных реакций на химические агенты. В настоящее время разрабатывают «белковые» микрочипы для определения протеома.
- Эффективность (и токсичность) медикаментозного лечения зависит от многих факторов, в первую очередь генетических,  а  также кишечной флоры. Многие микроорганизмы синтезируют соединения, которые активируют ферменты, ответственные за процессы детоксикации в печени,  а  ряд метаболитов микробного происхождения является непременным участником обмена веществ у человека.

Приложенные файлы

  • docx 23669246
    Размер файла: 389 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий